Explants rétiniens entières de poulet embryons pour Traitements électroporation et réactif chimique

La rétine est une partie du système nerveux central et il est, avec sa relative simplicité et de l'architecture cellulaire bien caractérisée, un modèle populaire pour étudier le développement du système nerveux central. L'oeil de l'embryon de poulet est relativement grande en comparaison avec le reste de l'embryon. Il est donc facilement accessible in ovo à des manipulations expérimentales, telles que des injections ou l'électroporation, et sert un excellent outil pour acquérir des connaissances sur cellules rétiniennes et la biologie du développement in vivo. Malgré ces avantages majeurs, la survie des embryons peut être faible lorsque les expériences sont envahissantes comme avec électroporations, des injections répétées, ou des manipulations expérimentales combinées.

L'électroporation de plasmides d'ADN dans l'embryon de poulet in ovo est une technique importante et bien établie ^1. Il permet pour l'étiquetage des neurones, le traçage du destin cellulaire ainsi que voies neuronales dans la NERV centraleous système et il permet l'expression ectopique des gènes à analyser la fonction des protéines in vivo. La technique a été utilisée pour les études de tube neural ^2, Rhombencéphale ^{3, 4} et de la rétine. Électroporation de la rétine embryonnaire in ovo a quelques difficultés expérimentales qui sont liés à la situation in vivo. La position de l'oeil, en raison du pliage du crâne de l'embryon, est relativement proche du cœur. Cette proximité augmente le risque d'un arrêt cardiaque suivant l'électroporation, et le risque augmente avec l'âge de l'embryon. En outre, pour accéder à l'œil, il est nécessaire d'ouvrir les membranes embryonnaires, ce qui augmente le risque de saignement, des malformations et après la viabilité réduite. Lors de l'essai et l'optimisation d'un nouveau plasmide d'ADN souvent sans un résultat phénotypique connu, ces limitations peuvent diminuer l'efficacité et la puissance de la méthode, même pour un expérimentateur expérimenté. Tel que présenté dans ce protocole, la culture de la wexplant trou rétinien, définie comme la rétine neurale ensemble avec l'épithélium pigmentaire enlevée, est un procédé efficace qui complète l'approche en ovo.

Injections intraoculaires de réactifs chimiques sont relativement faciles à réaliser in ovo. Cependant, la concentration efficace et précise des réactifs injectés au sein de la rétine neurale peut être difficile de contrôler entièrement. Le volume injecté peut varier en raison de fuites et l'emplacement exact de l'injection peut affecter à la fois la distribution du réactif dans l'oeil et de la diffusion à travers le corps vitré. La variabilité aura des implications majeures pour l'interprétation des résultats lorsque ie, une courbe dose-réponse pour un inhibiteur de l'enzyme est déterminée; en particulier si l'effet est faible et la fenêtre temporelle de l'effet est étroite. En outre, un seul œil peut être utilisé à partir de chaque embryon lors de l'exécution dans des expériences in ovo en raison des effets potentiels systémiques par le biais du flux sanguinsur l'oeil controlatéral. Age appariement est important lorsque l'on étudie le développement et la variabilité individuelle entre traités et les embryons de contrôle peut conduire à la variabilité expérimentale supplémentaire.

Pour ces raisons, un procédé ex ovo basé sur des explants de rétine embryons de poulet a été développé, dans lequel la rétine neurale peut être exposé à un uniforme et contrôlée condition expérimentale in vitro. Le présent protocole a été développé sur la base de protocoles antérieurs ^5-9. Explants de rétine à partir de l'étape (st) 20 (jours embryonnaires [E] 3) à ST31 (E7) d'embryons de poulet ont été disséquées, cultivées et soumises à une électroporation avec une concentration d'ADN de plasmide défini ou exposées à un milieu contenant une concentration définie d'un réactif chimique. Le protocole présenté ici a été mis en œuvre avec succès dans des publications récentes, utilisant plusieurs réactifs chimiques différents, y compris les régulateurs de la voie de dommages à l'ADN, comme KU55933, SB 218078, et NSC 109555 ditosylate, et le cycle cellulaire, tel que Cdk1 / 2 ^10,11 inhibiteur III.