Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

A retina é parte do sistema nervoso central e é, com a sua relativa simplicidade e arquitetura celular bem caracterizada, um modelo popular para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso central. O olho de embrião de galinha é relativamente grande em comparação com o resto do embrião. É, portanto, facilmente acessível in ovo para manipulações experimentais, tais como injecções ou eletroporação, e serve como uma ferramenta excelente para adquirir conhecimento sobre células da retina e biologia do desenvolvimento in vivo. Apesar destas vantagens principais, a sobrevivência dos embriões pode ser baixo quando as experiências são invasivos, como com electroporations, injeções repetidas, ou manipulações experimentais combinados.

A electroporação de plasmídeos de ADN para o embrião de galinha in ovo é uma técnica importante e bem estabelecido ^1. Ela permite a marcação de neurónios, o rastreio de destino celular, bem como vias neuronais no centro nervous sistema e que permite a expressão ectópica de genes para analisar a função da proteína in vivo. A técnica tem sido utilizada para estudos de tubo neural ^2, rombencéfalo ^{3, 4} e da retina. Eletroporação de retina embrionária in ovo tem algumas dificuldades experimentais que estão relacionados com a situação in vivo. A posição do olho, devido à dobragem cranial do embrião, é relativamente perto do coração. Esta proximidade aumenta o risco de paragem cardíaca após a electroporação, e o risco aumenta com a idade do embrião. Além disso, para aceder ao olho, que é necessário para abrir as membranas embrionárias, aumentando assim o risco de sangramento, malformações e subsequente viabilidade reduzida. Ao testar e otimizar um novo plasmídeo DNA, muitas vezes sem um resultado fenotípico conhecido, as limitações podem diminuir a eficácia e poder do método, mesmo para um experimentalista experiente. Conforme apresentado neste protocolo, a cultura do wfuro explante da retina, definida como toda a retina neural com o epitélio pigmentar removido, é um método eficiente em que complementa a abordagem in ovo.

Injecções intra-ocular de reagentes químicos são relativamente fáceis de executar in ovo. No entanto, a concentração eficaz e exacta de reagentes injectados dentro da retina neural pode ser difícil de controlar totalmente. O volume injectado pode variar devido a fugas e o local exacto de injecção podem afetar tanto a distribuição do reagente no interior do olho e a difusão através do corpo vítreo. A variabilidade terá grandes implicações para a interpretação dos resultados, quando isto é, uma curva dose-resposta para um inibidor da enzima é determinada; particularmente se o efeito é pequeno e a janela temporal do efeito é estreita. Além disso, apenas um único olho pode ser usado de cada embrião quando realizando experiências in ovo devido a possíveis efeitos sistémicos através da corrente sanguíneapara o olho contralateral. Combinando a idade é importante quando se estuda o desenvolvimento ea variabilidade individual entre tratados e embriões de controle pode levar a variabilidade experimental adicional.

Por estas razões, um ex ovo método baseado em explantes de retina de embriões de galinha foi desenvolvido, em que a retina neural pode ser exposto a uma uniforme e controlada condição experimental in vitro. O presente protocolo foi desenvolvido com base em protocolos anteriores ^5-9. Explantes de retina de fase (ST) 20 (dias embrionárias [E] 3) para ST31 (E7) embriões de galinha foram dissecadas, e cultivadas a electroporação com um plasmídeo de ADN definida concentração ou expostos a um meio contendo uma concentração definida de um reagente químico. O protocolo apresentado aqui foi implementado com sucesso em publicações recentes, usando vários reagentes químicos diferentes, incluindo reguladores da via danos no DNA, tais como KU55933, SB 218078, 109555 e NSC ditosylate, e o ciclo celular, tais como Cdk1 / 2 inibidor III ^10,11.