エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

網膜は中枢神経系の一部であり、その相対的な簡単さと十分に特徴付け細胞構造、中枢神経系の発達を研究するための人気のあるモデルです。ニワトリ胚の眼は、胚の残りの部分に比べて相対的に大きいです。従って、このような注射またはエレクトロポレーションなどの実験操作のための卵内に容易にアクセスでき、網膜細胞や生体内で発生生物学に関する知識を得るための優れたツールとして機能します。実験は、エレクトロポレーション、反復注射、または組み合わせた実験操作と同様に侵襲的であるとき、これらの主要な利点にもかかわらず、胚の生存率は低くすることができます。

卵内ニワトリ胚へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは重要であり、十分に確立された技術¹です。これは、神経細胞の標識化を可能にする細胞の運命の追跡だけでなく、中央NERVにおける神経管OUのシステムは、それがインビボでタンパク質機能を解析するための異所性の遺伝子発現を可能にします。技術は^、3後脳、および⁴網膜、神経管²の研究のために使用されてきました。 卵内胚網膜のエレクトロポレーションは、in vivoでの状況に関連したいくつかの実験の困難を持っています。胚の頭蓋折りたたみに起因する目の位置は、心臓に比較的近いです。この接近は、エレクトロポレーション後の心停止のリスク、および胚の年齢とともにリスク増加が増加します。また、目にアクセスするために、それによって出血、奇形およびその後の生存率減少のリスクを増加させる、胚の膜を開くことが必要です。既知の表現型の結果なしで、多くの場合、新たなDNAプラスミドをテストし、最適化する場合、これらの制限はあっても、経験豊富な実験者のための方法の有効性とパワーを減少させることができます。このプロトコルは、Wの文化の中で提示したよう削除色素上皮と神経網膜全体として形成された孔網膜外植は、OVOのアプローチで補完する効率的な方法です。

化学試薬の眼内注射は 、OVO で実行するのが比較的容易です。しかし、神経網膜内注射、試薬の有効かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。注入量は、漏れに変えることができ、注射の正確な部位は、眼内の試薬の分布と硝子体を通して拡散の両方に影響を与える可能性があります。酵素阻害剤のための、すなわち、用量応答曲線を決定する際の変動は、結果の解釈のために主要な影響を有することになります。特に効果が小さく、効果の時間窓が狭い場合。血流を介し潜在的な全身作用のために、OVOの実験で行うときにまた、唯一の目には、各胚から使用することができます反対側の眼へ。開発および処置および対照胚は、追加実験の変動につながる可能性の間の個体差を検討する際に年齢のマッチングが重要です。

これらの理由のために、ニワトリ胚の網膜外植片に基づく方法卵EXは、神経網膜を均一に露出し、 インビトロで実験条件を制御することが可能で、開発されました。現在のプロトコルは、以前のプロトコル^5-9に基づいて開発されました。ステージからの網膜外植体（ST）、ST31〜20（3胚日[E]）は、（E7）は、ニワトリ胚を培養し、解剖し、エレクトロポレーション定義DNAプラスミドの濃度または化学試薬の規定された濃度を含有する培地に曝露しました。ここで紹介するプロトコルは成功し、このようなKU55933、SB 218078、およびNSC 109555 DITOなどのDNA損傷経路の調節因子を含む、いくつかの異なる化学試薬を使用して、最近の出版物に実装されましたこのようするCdk1 / 2阻害剤III ^10,11としてsylate、および細胞周期、。