Summary

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

Published: September 30, 2015
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Abstract

הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי.

פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.

Introduction

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות.

Electroporation של פלסמידים DNA לעובר העוף באובו הוא טכניקה חשובה ומבוססת 1. היא מאפשרת תיוג של תאי עצב, התחקות של גורל תא, כמו גם שטחים עצביים בnerv המרכזימערכת היחידות הארגוניות והיא מאפשרת לביטוי גנים מחוץ לרחם לנתח תפקוד חלבון in vivo. הטכניקה נוצלה בעבר ללימודים של צינור עצבי 2, המוח האחורי 3, ורשתית 4. יש Electroporation של רשתית עוברית באוב כמה קשיים ניסיוניים הקשורים למצב in vivo. העמדה של העין, בשל קיפול הגולגולת של העובר, קרובה יחסית ללב. קרבה זו מגדילה את הסיכון של דום לב לאחר electroporation, והסיכון עולה עם גיל העובר. יתר על כן, כדי לגשת לעין, יש צורך לפתוח את הקרומים העובריים, ובכך להגדיל את הסיכון לדימום, מומים וכדאיות מופחתים שלאחר מכן. כאשר בודקים ואופטימיזציה פלסמיד דנ"א חדש לעתים קרובות ללא תוצאה פנוטיפי ידועה, מגבלות אלה עשויות להקטין את היעילות וכוחה של השיטה אפילו בניסויים מנוסים. כפי שהוצג בפרוטוקול זה, התרבות של wexplant החור ברשתית, שהוגדר כרשתית עצבית השלמה עם אפיתל הפיגמנט הוסר, הוא שיטה יעילה המשלימה בגישת אוב.

זריקות תוך עיניות של ריאגנטים כימיים קלות יחסית לביצוע באוב. עם זאת, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים שהוחדרו בתוך הרשתית העצבית עלול להיות קשה לשלוט באופן מלא. הנפח המוזרק עשוי להשתנות עקב דליפה ואתר הזרקה המדויק עשוי להשפיע הן על חלוקת מגיב בתוך העין ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. ההשתנות תהיה השלכות משמעותיות על הפרשנות של התוצאות כאשר כלומר, עקומת תגובה למינון מעכב אנזים נקבעה; במיוחד אם ההשפעה היא קטנה והחלון הזמני של ההשפעה הוא צר. יתר על כן, רק עין אחת יכולה לשמש מכל עובר בעת ביצוע ניסויים באובו בשל השפעות מערכתיות פוטנציאליות דרך זרם הדםעל העין הנגדית. התאמת גיל היא חשובה כאשר לומדים פיתוח והשתנות בודדות בין מטופלים ועוברים בקרה עשויה להוביל לשונות ניסיוניות נוספות.

מסיבות אלה, לשעבר אוב שיטה המבוססת על explants רשתית מעוברי עוף פותח, שברשתית העצבית יכולה להיות חשופה למדים ובשליטת תנאי ניסוי במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי פותח על בסיס פרוטוקולים קודמים 5-9. explants רשתית מבמה (רח ') 20 (ימים עובריים [E] 3) לst31 (E7) עוברי עופות נותחו, תרבותי וelectroporated עם ריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר או שנחשפו למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי. הפרוטוקול המובא כאן כבר מיושם בהצלחה בפרסומים האחרונים, באמצעות כמה ריאגנטים כימיים שונים, כולל רגולטורים של מסלול הנזק לדנ"א, כגון KU55933, SB 218,078, ומועצה לביטחון לאומי 109,555 דיטוsylate, ומחזור התא, כגון Cdk1 / 2 מעכב שלישי 10,11.

Protocol

פרוטוקול זה מתבצע בהתאם להמלצות ב" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של האגודה למחקר ברפואת עיניים וראייה ". 1. טיפול בביצה וגביית עיניים אחסן ביצי ליבורנו הלבנות ב12-14 מעלות צלז…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (איור 1 א-ו) וculturing של explants רשתית השלם מעוברי תרנגולת. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לכל explants רשתית מעוברים של ST20 (E3) לst31 (E7). Electroporation של פלסמידים DNA לתוך explants רשתית שלם מאפשר תיוג ומעקב של תאים ברשתית או בי?…

Discussion

בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות.

Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Materials

1xPBS (tablet) Life technologies 18912-014
10xDPBS Life technologies 14080-048
100 mm Petri dish VWR 734-0006
100 μL pipette tips VWR 613-0798
1.5 mL disposable plastic cuvette Thomas Scientific 8495V01
24-well plate Sigma Aldrich D7039
35 mm Petri dish VWR 391-1998
70% ethanol Solveco 1054
Cdk1/2 inhibitor III 217714 Calbiochem 300nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator Thermo Forma
Dissecting microscope Leica
DMEM Life Technologies 41966-029
Electrodes Platina, custom made
Electro square porator ECM 830 Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix Life Technologies 31331-028
FBS Life Technologies 16140-071
Forceps AgnThos 0108-5-PS
Freezing medium NEG50 Cellab, Sweden 6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany 8204
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
L-glutamine Life Technologies 25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI Life Technologies P36935
Paraffin film VWR 291-1214P
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold  Sigma Aldrich E6032
Penicillin streptomycin Life Technologies 15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)  Millipore 06-570 Dilution 1/4000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles") Sargenta 390-R (rondeller) Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes  Sonidel CUY700P4L Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette VWR 612-2853
Rotator shaker VWR 444-2900
Small spoon VWR 231-2151
Sucrose VWR 443815S
White Leghorn eggs Local supplier
Wine cooler WineMaster 24, Caso, Berlin Germany

References

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
  2. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
  3. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
  4. Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
  5. Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
  6. Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
  8. Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
  9. Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
  10. Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
  11. Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  13. Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
  14. Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
  15. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).

Play Video

Cite This Article
Shirazi Fard, S., Blixt, M., Hallböök, F. Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments. J. Vis. Exp. (103), e53202, doi:10.3791/53202 (2015).

View Video