Summary

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

Published: September 30, 2015
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen.

Abstract

Die Retina ist ein gutes Modell für die Entwicklung des zentralen Nervensystems. Die Größe des Auges und vor allem die Zugänglichkeit für experimentelle Manipulationen in ovo / in vivo macht das Huhn embryonalen Netzhaut eine vielseitige und sehr effiziente Versuchsmodell. Obwohl das Huhn Netzhaut ist leicht, in ovo durch intraokulare Injektion oder Elektroporation Ziel kann die effektive und genaue Konzentration der Reagenzien in der Netzhaut schwierig zu voll Kontrolle. Dies kann aufgrund von Abweichungen von der genauen Injektionsstelle, Leckage aus dem Auge oder unebenen Diffusion der Substanzen sein. Ferner wird die Frequenz von Fehlbildungen und Mortalität nach invasive Manipulationen wie Elektroporation ziemlich hoch.

Dieses Protokoll beschreibt einen ex ovo Technik zum Züchten gesamte Retina Explantaten aus Hühnerembryonen und liefert ein Verfahren zur kontrollierten Exposition der Retina Reagenzien. Die protocol beschreibt, wie zu zerlegen, experimentell zu manipulieren, und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Die Explantate können die etwa 24 h, kultiviert werden und verschiedene Manipulationen wie Elektroporation unterworfen werden. Die wesentlichen Vorteile sind, dass der Versuch nicht abhängig vom Überleben der Embryos und daß die Konzentration des eingebrachten Reagens kann variieren, und um zu bestimmen und zu optimieren, die effektive Konzentration gesteuert werden. Weiterhin ist die Technik eine schnelle, billige und zusammen mit ihren hohen experimentellen Erfolgsquote, reproduzierbar sichergestellt, Ergebnisse. Es sollte betont werden, dass es als eine ausgezeichnete Ergänzung zum Experiment in ovo ausgeführt dient.

Introduction

Die Retina ist ein Teil des zentralen Nervensystems, und es ist mit seiner relativen Einfachheit und gut charakterisierte Zellarchitektur, ein beliebtes Modell zum Studium der Entwicklung des zentralen Nervensystems. Das Auge des Hühnerembryo ist im Vergleich zu dem Rest des Embryos relativ groß. Es ist daher in ovo für experimentelle Manipulationen, wie Injektionen oder Elektroporation leicht zugänglich ist, und dient als ein hervorragendes Werkzeug, um das Wissen über Netzhaut Zell- und Entwicklungsbiologie in vivo zu gewinnen. Trotz dieser großen Vorteile, kann das Überleben der Embryonen niedrig sein, wenn Experimente sind invasive, wie mit Elektroporationen, wiederholte Injektionen oder kombinierte experimentelle Manipulationen.

Elektroporation von DNA-Plasmiden in den Hühnerembryo in ovo ist ein wichtiges und gut etablierte Technik 1. Es ermöglicht die Kennzeichnung von Neuronen, das Aufspüren des Zellschicksals und neuronalen Bahnen im zentralen nervous System und es ermöglicht die ektopische Genexpression auf Proteinfunktion in vivo zu analysieren. Die Technik hat sich für die Untersuchung der neuronalen Rohr 2 eingesetzt wurde, Rautenhirn 3 und 4 Retina. Elektroporation der embryonalen Retina in ovo hat einige experimentellen Schwierigkeiten, die der Situation in vivo in Zusammenhang stehen. Die Position des Auges, durch den Schädel Faltung des Embryos, relativ nahe an das Herz. Diese Nähe erhöht das Risiko von Herzstillstand nach der Elektroporation und das Risiko steigt mit dem Alter des Embryos. Darüber hinaus, um das Auge gelangen, ist es notwendig, die Eihüllen zu öffnen, wodurch das Risiko für Blutungen, Fehlbildungen und anschließende verminderte Lebensfähigkeit zu. Bei der Prüfung und Optimierung einer neuen DNA-Plasmid, oft ohne bekannte phänotypische Ergebnis können diese Einschränkungen der Wirksamkeit und Leistung des Verfahrens selbst für einen erfahrenen Experimentator zu verringern. Wie in diesem Protokoll der Kultur der w vorgestelltLoch retinalen Explantat, definiert als die gesamte neurale Retina mit Pigmentepithel entfernt wird, ist eine effiziente Methode, die in ovo Ansatz ergänzt.

Intraokulare Injektionen von chemischen Reagenzien sind relativ einfach in ovo auszuführen. Jedoch kann die effektive und genaue Konzentration der injizierten Reagenzien innerhalb des neuralen Retina schwierig, vollständig zu steuern. Das injizierte Volumen durch Lecks variieren und die genaue Stelle der Injektion kann sowohl die Verteilung des Reagens in das Auge und die Diffusion durch den Glaskörper zu beeinflussen. Die Variabilität wird erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation der Ergebnisse, wenn dh eine Dosis-Antwort-Kurve für einen Enzym-Inhibitor festgestellt haben; Insbesondere, wenn der Effekt klein ist und die Zeitfenster der Effekt ist gering. Darüber hinaus nur ein einziges Auge kann von jedem Embryo bei der Durchführung von in-ovo-Experimente durch, um mögliche systemische Wirkungen über den Blutstrom verwendet werdenauf das andere Auge. Alter Anpassung ist wichtig, wenn das Studium der Entwicklung und die individuelle Variabilität zwischen behandelten und Kontroll Embryonen zu zusätzlichen experimentellen Variabilität führen.

Aus diesen Gründen wurde ein ex ovo Verfahren basierend auf retinale Explantaten aus Hühnerembryos entwickelt, bei dem das neurale Retina kann zu einer gleichmäßigen und kontrollierten ausgesetzt experimentellen Bedingungen in vitro werden. Die vorliegende Protokoll wurde auf der Grundlage früherer Protokolle 5-9 entwickelt. Retinal Explantate aus Stufe (St) 20 (embryonalen Tagen [E] 3) bis ST31 (E7) Hühnerembryonen wurden präpariert, kultiviert und Elektroporation mit einer definierten DNA-Plasmid-Konzentration oder zu einem Medium, das eine definierte Konzentration eines chemischen Reagens ausgesetzt wird. Das hier vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich in jüngsten Veröffentlichungen implementiert, unter Verwendung mehrerer verschiedener chemischer Reagenzien, einschließlich Regulatoren der DNA-Schaden-Weges, wie KU55933, SB 218.078 und NSC 109555 ditosylate und der Zellzyklus wie Cdk1 / 2-Inhibitor III 10,11.

Protocol

Dieses Protokoll wird in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der Association for Research in Vision und Augenheilkunde" durchgeführt. 1. Egg Handhabung und Augen Sammlung Bewahren weißen Leghorn Eier bei 12-14 ° C nicht länger als 1 Woche. Falls verfügbar, verwenden Sie einen gekühlten Weinkühler, um die befruchtete Eier zu speichern. Hinweis: Höhere Speichertemperaturen führen zu abno…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung (1A-F) und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die gesamte Netzhaut Explantaten aus Embryonen von st20 (E3) zu ST31 (E7) verwendet. Elektroporation von DNA-Plasmiden zu ganzen Netzhaut-Explantate ermöglicht die Kennzeichnung und Rückverfolgung von retinalen Vorläuferzellen oder Überexpression von verschiedenen Genprodukten. Zur Elektroporation Experimen…

Discussion

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Präparation, Elektroporation oder chemische Behandlung, und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen wird vorgestellt. Dieses Protokoll ist einfach, schnell und ermöglicht sowohl eine hohe Erfolgsrate und reproduzierbare Ergebnisse.

Elektroporation von ganzen Netzhaut-Explantate produziert große Bereiche der Zellen, die das Gen-Konstrukt von Interesse exprimieren. Es ist leicht, die…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Materials

1xPBS (tablet) Life technologies 18912-014
10xDPBS Life technologies 14080-048
100 mm Petri dish VWR 734-0006
100 μL pipette tips VWR 613-0798
1.5 mL disposable plastic cuvette Thomas Scientific 8495V01
24-well plate Sigma Aldrich D7039
35 mm Petri dish VWR 391-1998
70% ethanol Solveco 1054
Cdk1/2 inhibitor III 217714 Calbiochem 300nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator Thermo Forma
Dissecting microscope Leica
DMEM Life Technologies 41966-029
Electrodes Platina, custom made
Electro square porator ECM 830 Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix Life Technologies 31331-028
FBS Life Technologies 16140-071
Forceps AgnThos 0108-5-PS
Freezing medium NEG50 Cellab, Sweden 6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany 8204
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
L-glutamine Life Technologies 25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI Life Technologies P36935
Paraffin film VWR 291-1214P
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold  Sigma Aldrich E6032
Penicillin streptomycin Life Technologies 15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)  Millipore 06-570 Dilution 1/4000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles") Sargenta 390-R (rondeller) Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes  Sonidel CUY700P4L Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette VWR 612-2853
Rotator shaker VWR 444-2900
Small spoon VWR 231-2151
Sucrose VWR 443815S
White Leghorn eggs Local supplier
Wine cooler WineMaster 24, Caso, Berlin Germany

References

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Cite This Article
Shirazi Fard, S., Blixt, M., Hallböök, F. Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments. J. Vis. Exp. (103), e53202, doi:10.3791/53202 (2015).

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