Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per il test del micronucleo del blocco della citochinesi su campioni di sangue intero crioconservato. Questo metodo ottimizzato di crioconservazione del sangue intero per l’analisi del micronucleo è una tecnica affidabile per il campionamento su larga scala e gli studi multicentrici e può essere utilizzato anche per altri test correlati al sangue.
Il test in vitro del micronucleo a blocco di citochinesi (CBMN) è una tecnica ampiamente utilizzata nella ricerca in radiobiologia, nella dosimetria biologica, negli studi di genotossicità e nei test di radiosensibilità in vitro . Questo metodo citogenetico si basa sull’individuazione di micronuclei in cellule binucleate derivanti da frammenti cromosomici in ritardo durante la divisione cellulare. I campioni di sangue intero fresco sono il tipo di campione preferito per il test CBMN. Tuttavia, gli svantaggi di lavorare con campioni di sangue fresco includono l’elaborazione immediata dopo la raccolta del sangue e il numero limitato di analisi ripetute che possono essere eseguite senza ulteriori prelievi di sangue.
Poiché la necessità di campioni di sangue fresco può essere logisticamente impegnativa, il test CBMN su campioni di sangue intero crioconservati sarebbe di grande vantaggio, soprattutto negli studi su pazienti su larga scala. Questo documento descrive un protocollo per congelare campioni di sangue intero ed eseguire il test CBMN su questi campioni di sangue congelato. I campioni di sangue di volontari sani sono stati congelati e scongelati in diversi momenti e poi sottoposti a un protocollo di analisi del micronucleo modificato. I risultati dimostrano che questa procedura ottimizzata consente l’esecuzione del test CBMN su campioni di sangue congelato. Il protocollo di crioconservazione descritto può essere molto utile anche per altri saggi citogenetici e per una varietà di saggi funzionali che richiedono linfociti proliferanti.
Fin dalla sua scoperta, l’uso delle radiazioni ionizzanti (IR) è stato oggetto di dibattito tra i ricercatori a causa dei suoi effetti negativi sugli esseri viventi. L’effetto dannoso si manifesta solitamente con danni al DNA come le rotture a doppio filamento (DSB) e la mancata riparazione di questi DSB porta ad aberrazioni cromosomiche e mutazioni, che sono importanti segni distintivi del cancro 1,2. Tali aberrazioni cromosomiche possono essere esaminate mediante saggi citogenici come il test del micronucleo a blocchi di citochinesi (CBMN). I micronuclei sono frammenti cromosomici ritardati che non possono essere incorporati nei nuclei figli e, quindi, vengono lasciati durante la mitosi.
La CBMN è una tecnica citogenetica affidabile e comunemente usata per valutare il danno cromosomico in individui esposti a radiazioni ionizzanti in vivo o in vitro. Nel test CBMN possono essere utilizzati sangue intero fresco o cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC). Il sangue intero fresco è per lo più il materiale biologico di scelta poiché l’isolamento e l’elaborazione delle PBMC possono richiedere molto tempo ed è accompagnata da una perdita di plasma sierico che funge da mezzo di supporto per la sopravvivenza e la crescita cellulare. Per ottenere una buona resa cellulare binucleata, il sangue intero fresco deve essere trattato immediatamente dopo la raccolta. Tuttavia, la necessità di un’elaborazione immediata può essere logisticamente impegnativa a causa dei vincoli di tempo. Inoltre, quando si suppone che molti campioni vengano acquisiti per un periodo prolungato o raccolti in punti lontani dai centri di elaborazione, la conservazione di campioni di sangue fresco può essere un fattore limitante 3,4.
Inoltre, per consentire l’analisi MN ripetuta nello stesso individuo/paziente, sarebbe utile il congelamento dei campioni di sangue. Un modo per conservare i linfociti per una successiva applicazione del test CBMN è il congelamento delle PBMC isolate 5,6. Questa tecnica, tuttavia, richiede diverse fasi di elaborazione prima che le PBMC possano essere congelate. Pertanto, la crioconservazione del sangue intero rappresenterebbe un’alternativa semplice ed efficiente in termini di tempo alla crioconservazione di PBMC isolate. Sono disponibili poche informazioni sull’uso del sangue intero congelato per i saggi citogenetici o per i saggi che richiedono la proliferazione dei linfociti. Solo un articolo riporta l’uso di sangue intero crioconservato per l’analisi della metafase7.
Poiché la crioconservazione del sangue intero offrirebbe molti vantaggi nel campo del biomonitoraggio, della biodosimetria e della valutazione della radiosensibilità, il nostro gruppo ha ottimizzato un protocollo di crioconservazione per il sangue intero che consente l’applicazione del test CBMN8. Abbiamo dimostrato che i linfociti presenti nelle colture di sangue intero crioconservate mantengono la loro integrità genomica e la capacità di proliferazione per almeno 1 anno. In questo documento sui metodi, descriviamo in dettaglio la procedura di crioconservazione e il protocollo del saggio CBMN, che è stato ottimizzato da Beyls et al.8, e riportiamo i risultati ottenuti per campioni di sangue congelati di 30 individui sani. Per il test CBMN, le emocolture sono state irradiate in vitro con dosi di 0,5, 1 e 2 Gy per valutare la risposta MN nei linfociti di campioni di sangue intero crioconservato.
Il protocollo modificato per l’applicazione del test CBMN è un modo relativamente semplice e conveniente per conservare campioni di sangue in massa. La procedura delinea tutti i dettagli minuti ma importanti che devono essere curati durante la crioconservazione e il test CBMN. Altri protocolli di laboratorio utilizzano normalmente il 10% di DMSO nella miscela di congelamento, mentre la nostra miscela di congelamento contiene il 20% di DMSO insieme all’80% di FCS7. Poiché questa miscela di congelamento viene aggiunta in volumi uguali al campione di sangue intero, anche la concentrazione finale è del 10% di DMSO. Per migliorare il tasso di sopravvivenza cellulare e stimolare la divisione cellulare, aggiungiamo l’1% di piruvato di sodio e lo 0,1% di beta-mercaptoetanolo al terreno di coltura completo (cRPMI). Questo è in accordo con il protocollo di coltura cellulare stabilito dal nostro gruppo di ricerca 6,8.
Sebbene il problema dell’aggregazione cellulare durante lo scongelamento non potesse essere risolto completamente in questo protocollo, la segregazione cellulare era migliore rispetto agli altri protocolli convenzionali. Invece di un’aggiunta costante e brusca di terreni di coltura per recuperare le cellule dopo lo scongelamento, abbiamo ottenuto risultati migliori quando il PBS preriscaldato (37 °C) è stato aggiunto goccia a goccia durante le fasi di lavaggio. Questo miglioramento aiuta a ridurre lo stress cellulare e riduce al minimo l’aggregazione con un comprovato elevato recupero di cellule. Inoltre, non è stata osservata alcuna chiara differenza nella vitalità cellulare quando il PBS è stato utilizzato su RPMI. È stato convalidato dal gruppo che la durata del periodo di crioconservazione (fino a 1 anno) non influirà sulle rese di MN, sia nei campioni irradiati che in quelli non irradiati 6,8. Gli studi suggeriscono che una buona vitalità cellulare e la proliferazione delle PBMC possono essere ottenute con un congelamento graduale a basse temperature (azoto liquido), seguito da un’aggiunta graduale di terreno preriscaldato durante lo scongelamento10,11. I ricercatori hanno dimostrato che le sottopopolazioni di linfociti T nel sangue intero scongelato sono paragonabili a quelle osservate nelle PBMCscongelate 12. Inoltre, è dimostrato che i sottotipi di cellule recuperati da campioni di sangue intero crioconservati sono simili a quelli osservati in campioni di sangue intero fresco13,14.
Se esaminiamo i risultati indicativi ottenuti nel rapporto, vediamo che l’aumento quadratico lineare con la dose (Figura 3) è in accordo con altri rapporti della letteratura sui micronuclei indotti dal trasferimento di energia lineare (LET)15,16. La variabilità delle rese di MN osservata nei campioni di sangue intero crioconservato (Tabella 1) è in linea con quella riportata per le colture di sangue intero fresco 8,17,18. Il protocollo qui descritto in dettaglio è stato validato su sangue intero fresco e crioconservato di 20 volontari sani8. L’indice di divisione nucleare (NDI), che è un parametro importante della proliferazione cellulare osservato in tale relazione8, era in accordo con quello suggerito per il sangue intero fresco19,20. Nel complesso, questo protocollo ottimizzato di crioconservazione del sangue intero e il test del micronucleo modificato forniscono una migliore resa cellulare e, pertanto, l’adattamento di questo protocollo è raccomandato per le valutazioni della radiosensibilità. Poiché la riproducibilità del protocollo è già stata validata8, si suggerisce di averne l’applicabilità in studi su larga scala e multicentrici.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare L. Pieters, T. Thiron e G. De Smet per il loro supporto tecnico. Siamo grati a tutti i volontari che hanno donato il sangue per lo studio. Il lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Research Foundation- Flanders (FWO) nell’ambito di Grant (T000118N).
15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |