Le dosage des micronoyaux sur du sang total cryoconservé

Pour cette étude, des échantillons de sang ont été prélevés par ponction veineuse auprès de 30 donneurs sains âgés de 17 à 65 ans. Les données MN de 20 donneurs ont été réutilisées à partir de l’article de Beyls et al.8 Le prélèvement des échantillons de sang est conforme aux directives du Comité d’éthique de l’Hôpital universitaire de Gand (numéro d’enregistrement : 2019/1565), Belgique. Le consentement éclairé écrit de tous les participants a été obtenu. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et réactifs utilisés dans ce protocole. 1. Prélèvement d’échantillons de sang Avant de commencer, assurez-vous que le consentement éclairé écrit des participants est disponible et que les directives éthiques sont correctement suivies. Recueillir le sang dans des tubes Li-Heparine et conserver à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit prêt à être traité pour la cryoconservation. 2. Cryoconservation du sang total REMARQUE : Toutes les étapes jusqu’à la récolte des cellules sont effectuées de manière aseptique dans un flux d’air laminaire stérile. Pour cryoconserver 1 mL de sang, préparez 1 mL de milieu de congélation en mélangeant 800 μL de sérum de veau fœtal (FCS) et 200 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).REMARQUE : Le milieu de congélation est préparé dans un volume égal aux échantillons de sang qui doivent être congelés. Pour la cryoconservation du sang total, transférer l’échantillon de sang du tube hépariné dans des tubes à centrifuger de 15 ou 50 mlREMARQUE : La capacité du tube dépend du volume de sang. Faire tourbillonner le sang à basse vitesse avec l’ajout continu mais goutte à goutte d’un volume égal de milieu de congélation. Transférer 2 mL de mélange de congélation de sang dans des flacons cryogéniques (2 mL) où chaque aliquote contient 1 mL d’échantillon de sang mélangé à 1 mL de mélange de congélation. Congélation progressive par étapesTransférez les flacons cryogéniques dans une boîte cryogénique contenant de l’isopropanol et mettez-les au congélateur (-80 °C) pendant la nuit. Transférez les flacons cryogéniques à l’azote liquide pour une utilisation à long terme. 3. Décongélation du sang cryoconservé REMARQUE : Pour limiter la durée totale du processus de décongélation, un maximum de 8 flacons cryogéniques (2 ml chacun) doivent être manipulés à la fois. PréparationPréchauffer 200 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à 37 °C avant de décongeler le sang. Préparer une solution de travail du milieu de culture requis dans des conditions stériles. S’assurer que le milieu par culture comprend 1,6 mL de milieu complet : milieu du Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) complété par de la pénicilline/streptomycine (0,5 %), 0,2 mL de FCS, 20 μL de pyruvate de sodium et 2 μL de β-mercaptoéthanol.REMARQUE : Étant donné qu’un nombre important de cellules sanguines peuvent être perdues lors de la décongélation, le sang décongelé est mis en culture dans de petits puits comme des plaques à 24 puits d’un volume total de 2 mL. Une plaque multipuits par dose est utilisée. Pour chaque puits de culture, indiquez le code du donneur et A/B sur le couvercle ainsi que la date et la dose, comme suggéré ci-dessous (figure 1). Figure 1 : Disposition suggérée d’une plaque à 24 puits pour la culture du sang total pour l’analyse du micronoyau. Marquez les puits et indiquez les codes des donneurs aux endroits appropriés sur le couvercle. Pour chaque échantillon de patient, les puits en double doivent être adjacents les uns aux autres. Notez qu’il s’agit d’une disposition suggestive pour un collimateur 10 x 10 et qu’elle peut être modifiée en fonction de la taille du collimateur ou des échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Étapes de la décongélation et de la culture du sang totalChauffer le bain-marie à 37 °C. Retirez les flacons cryogéniques nécessaires de l’azote liquide (le nombre dépend des besoins, comme le nombre de doses).REMARQUE : Un cryoflacon contient 1 mL de sang et 1 mL de milieu de congélation. Par conséquent, deux cultures peuvent être mises en place avec du sang provenant d’un seul cryoflacon. Décongelez partiellement les flacons cryogéniques dans le bain d’eau chaude (jusqu’à ce que de petits cristaux de glace soient encore visibles). Sortez les flacons du bain-marie et nettoyez l’extérieur des flacons avec du papier de soie stérile. Dans une hotte à flux d’air laminaire stérile, ouvrez les flacons très lentement pour éviter que les bulles d’air formées à l’intérieur des tubes ne se répandent. Remettre en suspension le contenu de chaque flacon et le transférer individuellement dans un tube à centrifuger conique de 15 ml (1 tube par flacon). Ajouter goutte à goutte 1 mL de PBS chaud (37 °C) dans les tubes respectifs tout en remuant doucement le tube. Remise en suspension à l’aide d’une pipette P1000. Pour une dilution et un lavage uniforme, ajouter goutte à goutte 7 mL de PBS préchauffé (37 °C) et remettre en suspension avec une pipette P1000. Centrifuger le sang pendant 8 min à 180 × g (avec réglage à l’accélération 1, frein 1) à température ambiante. Au cours de cette étape d’attente, remplissez les puits vides (autres que celui où les cellules seront cultivées) avec 500 μL de PBS. Replacez les plaques de puits dans l’incubateur pour les préchauffer. Une fois la centrifugation terminée, retirez délicatement le surnageant, en laissant environ 1 mL pour éviter de perturber la pastille cellulaire. Remettre la pastille en suspension dans le surnageant restant à l’aide d’une pipette P1000. Ajouter 8 mL de PBS chaud (37 °C) dans les tubes respectifs tout en remuant doucement les tubes. Ensuite, remettez en suspension avec une pipette P1000. Centrifuger le sang remis en suspension pendant 8 min à 180 × g (avec réglage à l’accélération 9, frein 9). Au cours de cette étape d’attente, transvaser 200 μL de milieu de culture dans chacun des puits marqués. Conservez les plaques dans l’incubateur pour qu’elles restent à 37 °C. Après la centrifugation, retirer le surnageant dans un mouvement continu (pour éviter de perturber la pastille de cellules libres), mais laisser environ 80 μL de surnageant. Ajouter 280 μL de FCS (température ambiante) à la pastille et remettre en suspension (jusqu’à un volume total de 360 μL). Transférer 180 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits et remettre en suspension (= 0,5 mL de « sang »/culture). Le volume total dans chaque puits est maintenant de 380 μL, ce qui donne une couche moyenne de 2 mm. Incuber les plaques dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant au moins 10 min avant l’irradiation. 4. Dosage G0 MN Sortez les plaques de l’incubateur et irradiez la culture cellulaire avec les doses requises telles que des rayons X de 0,5, 1 et 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) à température ambiante. Utiliser des échantillons simulés irradiés comme témoins pour identifier les rendements spontanés de MN. Immédiatement après l’irradiation, ajouter 1,62 mL de milieu de culture (37 °C) dans chaque puits. Pour stimuler la division cellulaire dans les lymphocytes T, ajoutez 40 μL de phytohémagglutinine (PHA) dans chaque puits et remettez-les en suspension soigneusement. Remettez ces plaques dans l’incubateur (5% CO2, 37 °C).REMARQUE : Ce sera l’heure de début de l’essai. Bloquer la cytokinèse 23 h après la stimulation en ajoutant 8 μL de cytochalasine B (6 μg/mL) par puits et remettre en suspension correctement. Récoltez les cultures cellulaires 70 h après la stimulation/le temps de culture. Remettre les cellules en suspension et les transférer dans un tube de 15 ml. Rincez chaque puits avec 2 mL de PBS et ajoutez ce PBS dans le tube respectif de 15 mL. Centrifuger les tubes pendant 8 min à 180 × g, à température ambiante. Jeter le surnageant, mais laisser environ 500 μL sur la pastille. Faire tourbillonner la pastille (à pleine vitesse) et, tout en faisant vortex, ajouter lentement 2 mL de chlorure de potassium froid (KCl, 4 °C). Centrifuger immédiatement les cellules à 180 × g pendant 8 min. Jeter le surnageant, en laissant environ 500 μL de surnageant. Tourbillonnez la pastille (à pleine vitesse) et pendant le vortex, ajoutez lentement 2 mL de fixateur froid 1 (solution méthanol/acide acétique/Ringer dans un rapport de 4 :1 :5). Laisser les tubes d’échantillons toute la nuit à 4 °C (minimum 12 h et maximum 96 h). Centrifuger pendant 8 min à 180 × g. Jeter le surnageant. Faire tourbillonner la pastille (à pleine vitesse) et, tout en effectuant le vortex, ajouter lentement 2 mL de fixateur froid 2 (méthanol/acide acétique dans un rapport de 4 :1). Centrifuger pendant 8 min à 180 × g. Jeter le surnageant. Faire vortex la pastille (à pleine vitesse) puis ajouter lentement (goutte à goutte), tout en vortexant, 2 mL de fixateur froid 2 à la pastille. Laisser les tubes d’échantillons à 4 °C (minimum 12 h et maximum 96 h). Nettoyez les lames avec de l’isopropanol et étiquetez-les correctement.REMARQUE : Utilisez des autocollants imprimés pour étiqueter car l’encre du marqueur s’efface facilement pendant le traitement. Centrifuger les tubes d’échantillon pendant 8 min à 180 × g. Transférez le surnageant dans un autre tube pour concentrer les cellules en fonction de la taille de la pastille. Vortex la pastille. Déposez 40 μL des cellules fixes sur une lame sèche et propre. Laissez sécher les lames à température ambiante. Conservez immédiatement les lames dans une boîte ou une teinture pour les observer. 5. Coloration à l’acridine orange (AO) Plongez les lames dans la teinture AO pendant 1 min, puis lavez-les rapidement dans l’eau distillée, puis placez-les dans un tampon phosphate (pH 6,8) pendant 1 min. Retirez les lames de la solution tampon et avec du papier de soie propre, séchez le dos des lames et placez les lames sur un papier de soie propre. Déposez 20 μL de tampon phosphate sur le dessus de la lame et couvrez-la délicatement avec une lamelle propre, en évitant les bulles d’air. Scellez ces lames avec du ciment silicone.REMARQUE : Étant donné que l’AO est sensible à la lumière et s’estompe avec le temps, pour un contraste et une fluorescence agréables, il est recommandé de marquer les lames dans les 5 jours suivant la coloration. Conservez toujours les lames dans une chambre froide (4 °C), lorsqu’elles ne sont pas examinées. 6. Marquer les diapositives tachées Placez votre lame sous un microscope à fluorescence et examinez 1 000 cellules binucléées (BN). Comptez manuellement les MN, qui sont l’un des six biomarqueurs de toxicité. Pour ce faire, demandez à deux correcteurs indépendants d’examiner 500 cellules BN par lame sous le même grossissement.REMARQUE : Voici quelques points saillants des critères de notation, tels que recommandés par Fenech pour noter les diapositives colorées9Sélectionnez une cellule BN en recherchant des cellules bien arrondies avec un cytoplasme intact, avec deux noyaux bien distingués d’environ la même taille, de la même forme régulière et du même motif de coloration. Assurez-vous que le cytoplasme de la cellule BN peut être distingué du cytoplasme de la cellule adjacente. Noter un MN, en notant qu’il est morphologiquement identique mais plus petit que les noyaux principaux ; même le plus grand MN ne peut pas dépasser 1/3 du diamètre des noyaux principaux. Ne notez un MN que s’il ne touche pas les noyaux principaux ou si au moins la limite micronucléaire peut être distinguée de la limite des noyaux principaux.