El ensayo de micronúcleos en sangre entera criopreservada

Para este estudio, se recogieron muestras de sangre por venopunción de 30 donantes sanos con edades comprendidas entre los 17 y los 65 años. Se reutilizaron los datos de MN de 20 donantes del artículo de Beyls et al.8 La recogida de las muestras de sangre se realiza de acuerdo con las directrices del Comité de Ética del Hospital Universitario de Gante (número de registro: 2019/1565), Bélgica. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo. 1. Recogida de muestras de sangre Antes de comenzar, asegúrese de que se dispone del consentimiento informado por escrito de los participantes y de que se siguen adecuadamente las pautas éticas. Recoja la sangre en tubos de heparina de litio y guárdela a temperatura ambiente hasta que esté lista para su procesamiento para la criopreservación. 2. Criopreservación de sangre total NOTA: Todos los pasos hasta la recolección celular se realizan asépticamente en un flujo de aire laminar estéril. Para criopreservar 1 ml de sangre, prepare 1 ml de medio de congelación mezclando 800 μl de suero fetal para terneros (FCS) y 200 μl de dimetilsulfóxido (DMSO).NOTA: El medio de congelación se prepara en un volumen igual a las muestras de sangre que deben congelarse. Para la criopreservación de sangre entera, transfiera la muestra de sangre del tubo heparinizado a tubos centrífugos de 15 o 50 mlNOTA: La capacidad del tubo depende del volumen de sangre. Agite la sangre a baja velocidad con la adición continua pero gota a gota de un volumen igual de medio de congelación. Transfiera 2 ml de mezcla de congelación de sangre a crioviales (2 ml) donde cada alícuota tiene 1 ml de muestra de sangre mezclada con 1 ml de mezcla de congelación. Congelación gradual por pasosTransfiera los crioviales a una caja criogénica que contenga isopropanol y colóquelos en un congelador (-80 °C) durante toda la noche. Transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su uso a largo plazo. 3. Descongelación de sangre criopreservada NOTA: Para limitar el tiempo total del proceso de descongelación, se debe manipular un máximo de 8 crioviales (2 ml cada uno) a la vez. PreparaciónPrecalentar 200 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C antes de descongelar la sangre. Preparar una solución de trabajo del medio de cultivo requerido en condiciones estériles. Asegúrese de que el medio por cultivo incluya 1,6 ml de medio completo: medio Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado con penicilina/estreptomicina (0,5%), 0,2 ml de FCS, 20 μl de piruvato de sodio y 2 μl de β-mercaptoetanol.NOTA: Dado que se puede perder una cantidad significativa de células sanguíneas durante la descongelación, la sangre descongelada se cultiva en pocillos pequeños como placas de 24 pocillos con un volumen total de 2 ml. Se utiliza una placa multipocillos por dosis. Para cada pocillo de cultivo, indique el código del donante y A/B en la tapa junto con la fecha y la dosis, como se sugiere a continuación (Figura 1). Figura 1: Diseño sugerido de una placa de 24 pocillos para cultivar sangre completa para el ensayo de micronúcleos. Marque los pocillos e indique los códigos de los donantes en los lugares apropiados de la tapa. Para cada muestra de paciente, los pocillos duplicados deben ser adyacentes entre sí. Tenga en cuenta que es un diseño sugerente para un colimador de 10 x 10 y se puede cambiar según el tamaño del colimador o de las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Pasos para descongelar y cultivar sangre enteraCalentar el baño maría a 37 °C. Saque los crioviales necesarios del nitrógeno líquido (el número depende de los requisitos, como el número de dosis).NOTA: Un criovial contiene 1 mL de sangre y 1 mL de medio de congelación. Por lo tanto, se pueden establecer dos cultivos con sangre de un criovial. Descongele parcialmente los crioviales en el baño de agua tibia (hasta que aún se vean pequeños cristales de hielo). Saque los viales del baño de agua y limpie el exterior de los viales con papel de seda estéril. En una campana de flujo de aire laminar estéril, abra los viales muy lentamente para evitar que se derramen las burbujas de aire formadas dentro de los tubos. Resuspender el contenido de cada vial y transferirlo individualmente a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL (1 tubo por vial). A los tubos respectivos, agregue gota a gota 1 ml de PBS tibio (37 °C) mientras agita suavemente el tubo. Vuelva a suspender con una pipeta P1000. Para una dilución y un lavado uniforme, añadir gota a gota 7 ml de PBS precalentado (37 °C) y volver a suspender con una pipeta P1000. Centrifugar la sangre durante 8 min a 180 × g (con ajuste en aceleración 1, freno 1) a temperatura ambiente. Durante este paso de espera, llene los pocillos vacíos (que no sean aquellos en los que se cultivarán las células) con 500 μL de PBS. Vuelva a colocar las placas de pocillos en la incubadora para precalentarlas. Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml para evitar perturbar el gránulo celular. Vuelva a suspender el gránulo en el sobrenadante restante con una pipeta P1000. Agregue gota a gota 8 ml de PBS tibio (37 °C) en los tubos respectivos mientras agita suavemente los tubos. A continuación, vuelva a suspender con una pipeta P1000. Centrifugar la sangre resuspendida durante 8 min a 180 × g (con ajuste a aceleración 9, freno 9). Durante este paso de espera, transfiera 200 μL de medio de cultivo a cada uno de los pocillos marcados. Mantenga las placas en la incubadora para que permanezcan a 37 °C. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con un movimiento continuo (para evitar perturbar el gránulo de células sueltas), pero deje aproximadamente 80 μL del sobrenadante. Al gránulo, añadir 280 μL de FCS (temperatura ambiente) y volver a suspender (hasta un volumen total de 360 μL). Transferir 180 μL de la suspensión celular a cada pocillo y resuspender (= 0,5 mL de “sangre”/cultivo). El volumen total en cada pocillo es ahora de 380 μL, lo que da como resultado una capa media de 2 mm. Incubar las placas en una incubadora de CO2 a 37 °C durante al menos 10 minutos antes de la irradiación. 4. Ensayo G0 MN Saque las placas de la incubadora e irradie el cultivo celular con las dosis requeridas, como radiografías de 0,5, 1 y 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) a temperatura ambiente. Utilice muestras irradiadas simuladas como controles para identificar los rendimientos espontáneos de MN. Inmediatamente después de la irradiación, añadir 1,62 ml de medio de cultivo (37 °C) a cada pocillo. Para estimular la división celular en los linfocitos T, agregue 40 μL de fitohemaglutinina (PHA) a cada pocillo y vuelva a suspender completamente. Vuelva a colocar estas placas en la incubadora (5% CO2, 37 °C).NOTA: Esta será la hora de inicio del ensayo. Bloquear la citocinesis 23 h después de la estimulación añadiendo 8 μL de citocalasina B (6 μg/mL) por pocillo y resuspender adecuadamente. Cosechar los cultivos celulares 70 h después de la estimulación/tiempo de cultivo. Vuelva a suspender y transfiera las células a un tubo de 15 ml. Enjuague cada pocillo con 2 ml de PBS y agregue este PBS al tubo de 15 ml correspondiente. Centrifugar los tubos durante 8 min a 180 × g, a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante pero deje aproximadamente 500 μL sobre el gránulo. Agite el pellet (a toda velocidad) y, durante el vórtice, agregue lentamente gota a gota 2 ml de cloruro de potasio frío (KCl, 4 °C). Centrifugar inmediatamente las células a 180 × g durante 8 min. Deseche el sobrenadante, dejando aproximadamente 500 μL del sobrenadante. Agite el gránulo (a toda velocidad) y, mientras lo hace en vórtice, agregue lentamente gota a gota 2 ml de fijador frío 1 (solución de metanol / ácido acético / Ringer en una proporción de 4: 1: 5). Dejar los tubos de muestra durante la noche a 4 °C (mínimo 12 h y máximo 96 h). Centrifugar durante 8 min a 180 × g. Deseche el sobrenadante. Agite el gránulo (a toda velocidad) y, mientras lo hace, agregue lentamente gota a gota 2 ml de fijador frío 2 (metanol/ácido acético en una proporción de 4:1). Centrifugar durante 8 min a 180 × g. Deseche el sobrenadante. Agite el gránulo (a toda velocidad) y luego agregue lentamente (gota a gota), mientras se agita el vórtice, 2 ml de fijador frío 2 al gránulo. Dejar los tubos de muestra a 4 °C (mínimo 12 h y máximo 96 h). Limpie los portaobjetos con isopropanol y etiquételos correctamente.NOTA: Utilice pegatinas impresas para etiquetar, ya que la tinta del marcador se limpia fácilmente durante el procesamiento. Centrifugar los tubos de muestra durante 8 min a 180 × g. Transfiera el sobrenadante a otro tubo para concentrar las células de acuerdo con el tamaño del gránulo. Vórtice el pellet. Deje caer 40 μL de las células fijas en un portaobjetos seco y limpio. Deja que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente. Guarde los portaobjetos en una caja o tinte inmediatamente para observarlos. 5. Tinción de naranja acridina (AO) Sumerja los portaobjetos en tinte AO durante 1 minuto, seguido de un lavado rápido en el agua destilada, y luego, coloque los portaobjetos en tampón de fosfato (pH 6.8) durante 1 minuto. Saque los portaobjetos de la solución tampón y, con papel de seda limpio, seque la parte posterior de los portaobjetos y colóquelos sobre un papel de seda limpio. Deje caer 20 μL del tampón de fosfato en la parte superior del portaobjetos y cúbralo suavemente con un cubreobjetos limpio, evitando burbujas de aire. Sella estos portaobjetos con cemento de silicona.NOTA: Dado que AO es sensible a la luz y se desvanece con el tiempo, para obtener un buen contraste y fluorescencia, se recomienda marcar los portaobjetos dentro de los 5 días posteriores a la tinción. Guarde siempre los portaobjetos en una cámara frigorífica (4 °C), cuando no los examine. 6. Puntuación de portaobjetos manchados Coloque su portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia y examine 1,000 células binucleadas (BN). Recuento manual de MN, que es uno de los seis biomarcadores de toxicidad. Para ello, pida a dos evaluadores independientes que examinen 500 células BN/portaobjetos con el mismo aumento.NOTA: A continuación se presentan algunos aspectos destacados de los criterios de puntuación, según lo recomendado por Fenech para puntuar los portaobjetos teñidos9Seleccione una célula BN buscando células bien redondeadas con citoplasma intacto, con dos núcleos bien distinguidos de aproximadamente el mismo tamaño, forma regular y patrón de tinción. Asegúrese de que el citoplasma de la célula BN se distinga del citoplasma de la célula adyacente. Puntúe un MN, señalando que es morfológicamente idéntico pero más pequeño que los núcleos principales; incluso el MN más grande no puede tener más de 1/3 del diámetro de los núcleos principales. Marque un MN solo si no toca los núcleos principales o al menos el límite micronuclear es distinguible del límite de los núcleos principales.