여기서는 냉동 보존된 전혈 샘플에 대한 사이토카인시스 블록 소핵 분석을 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 소핵 분석을 위한 전혈의 이 최적화된 냉동 보존 방법은 대규모 샘플링 및 다기관 연구에 신뢰할 수 있는 기술이며 다른 혈액 관련 분석에도 사용할 수 있습니다.
체외 사이토카인시스 블록 소핵(CBMN) 분석은 방사선 생물학 연구, 생물학적 선량 측정, 유전 독성 연구 및 체외 방사선 민감도 검사에서 널리 사용되는 기술입니다. 이 세포유전학적 방법은 세포 분열 중에 지연되는 염색체 조각으로 인한 이핵 세포의 미세핵 검출을 기반으로 합니다. 신선한 전혈 샘플은 CBMN 분석에 가장 선호되는 샘플 유형입니다. 그러나 신선한 혈액 샘플로 작업할 때의 단점은 혈액 채취 후 즉시 처리되고 추가 혈액 샘플링 없이 수행할 수 있는 반복 분석 횟수가 제한되어 있다는 것입니다.
신선한 혈액 샘플에 대한 필요성이 논리적으로 어려울 수 있기 때문에 냉동 보존된 전혈 샘플에 대한 CBMN 분석은 특히 대규모 환자 연구에서 큰 이점이 될 것입니다. 이 논문은 전혈 샘플을 동결하고 이러한 동결 혈액 샘플에 대해 CBMN 분석을 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 건강한 지원자의 혈액 샘플은 서로 다른 시점에서 동결 및 해동된 다음 수정된 소핵 분석 프로토콜을 거쳤습니다. 결과는 이 최적화된 절차가 냉동 혈액 샘플에 대한 CBMN 분석의 수행을 허용한다는 것을 보여줍니다. 설명된 동결 보존 프로토콜은 또한 다른 세포유전학 분석 및 증식하는 림프구를 필요로 하는 다양한 기능적 분석에 매우 유용할 수 있다.
발견 이후 이온화 방사선(IR)의 사용은 생명체에 대한 악영향 때문에 연구자들 사이에서 논쟁의 대상이 되어 왔습니다. 해로운 영향은 일반적으로 이중 가닥 절단(DSB)과 같은 DNA 손상에 의해 나타나며, 이러한 DSB를 복구하지 못하면 암의 중요한 특징인 염색체 이상 및 돌연변이가 발생합니다 1,2. 이러한 염색체 이상은 사이토키네시스 블록 소핵(cytokinesis-block micronucleus, CBMN) 분석과 같은 세포형성 분석법으로 검사할 수 있다. 소핵은 딸핵에 통합될 수 없는 후행 염색체 조각이므로 유사분열 중에 남게 됩니다.
CBMN은 생체 내 또는 체외 이온화 방사선에 노출된 개인의 염색체 손상을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 신뢰할 수 있는 세포유전학 기술입니다. 신선한 전혈 또는 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 CBMN 분석에 사용할 수 있습니다. PBMC의 분리 및 처리는 시간이 많이 걸리고 세포 생존 및 성장을 위한 지지 매체 역할을 하는 혈청 혈장의 손실이 수반될 수 있기 때문에 신선한 전혈이 대부분 선택되는 생물학적 물질입니다. 양호한 이핵 세포 수율을 달성하려면 채취 직후 신선한 전혈을 처리해야 합니다. 그러나 즉각적인 처리의 필요성은 시간 제약으로 인해 물류적으로 어려울 수 있습니다. 더욱이, 많은 샘플이 장기간에 걸쳐 수집되거나 처리 센터에서 멀리 떨어진 지점에서 수집되어야 하는 경우, 신선한 혈액 샘플의 보관은 제한 요인이 될 수 있습니다 3,4.
또한, 동일한 개인/환자에서 반복적인 MN 분석을 허용하려면 혈액 샘플을 동결하는 것이 좋습니다. CBMN 분석실험의 나중에 적용을 위해 림프구를 저장하는 한 가지 방법은 분리된 PBMC 5,6을 동결하는 것입니다. 그러나 이 기술은 PBMC를 동결하기 전에 몇 가지 처리 단계를 거쳐야 합니다. 따라서 전혈의 동결 보존은 분리된 PBMC의 동결 보존에 대한 간단하고 시간 효율적인 대안이 될 것입니다. 림프구의 증식이 필요한 세포유전학 분석 또는 분석을 위한 냉동 전혈의 사용에 관한 정보는 거의 없습니다. 중기 분석을 위해 냉동 보존된 전혈을 사용한다고 보고한 논문은단 한 편뿐이다 7.
전혈의 동결 보존은 생체 모니터링, 생체 선량 측정 및 방사선 민감도 평가 분야에서 많은 이점을 제공하기 때문에 우리 그룹은 CBMN 분석의 적용이 가능한 전혈에 대한 동결 보존 프로토콜을 최적화했습니다8. 우리는 냉동 보존된 전혈 배양에 존재하는 림프구가 최소 1년 동안 게놈 무결성과 증식 능력을 유지한다는 것을 입증했습니다. 이 방법 논문에서는 Beyls et al.8에 의해 최적화된 동결 보존 절차 및 CBMN 분석 프로토콜을 자세히 설명하고 30명의 건강한 개인의 냉동 혈액 샘플에 대해 얻은 결과를 보고합니다. CBMN 분석의 경우, 동결 보존된 전혈 샘플의 림프구에서 MN 반응을 평가하기 위해 0.5, 1 및 2 Gy의 용량으로 혈액 배양을 시험관 내에서 조사했습니다.
CBMN 분석의 적용을 위한 수정된 프로토콜은 혈액 샘플을 대량으로 저장하는 비교적 쉽고 편리한 방법입니다. 이 절차는 동결 보존 및 CBMN 분석 중에 처리해야 하는 모든 미세하지만 중요한 세부 사항을 간략하게 설명합니다. 다른 실험실 프로토콜은 일반적으로 동결 혼합물에 10% DMSO를 사용하는 반면, 당사의 동결 혼합물에는 80% FCS와 함께 20% DMSO가 포함되어있습니다 7. 이 동결 혼합물이 전혈 샘플에 동일한 부피로 첨가되기 때문에 최종 농도도 10% DMSO입니다. 세포 생존율을 높이고 세포 분열을 촉진하기 위해 1% 피루브산 나트륨과 0.1% 베타-메르캅토에탄올을 완전 배양 배지(cRPMI)에 첨가합니다. 이는 당사 연구 그룹 6,8에서 수립한 세포 배양 프로토콜에 따른 것입니다.
해동 중 세포 응집 문제는 이 프로토콜에서 완전히 해결할 수 없었지만 세포 분리는 다른 기존 프로토콜보다 우수했습니다. 해동 후 세포를 회수하기 위해 배양 배지를 일관되고 갑작스럽게 추가하는 대신, 세척 단계에서 예열된 PBS(37°C)를 적가했을 때 더 나은 결과를 얻었습니다. 이러한 개선은 세포 스트레스를 줄이는 데 도움이 되며 입증된 높은 세포 회수율로 뭉침을 최소화합니다. 또한, RPMI를 통해 PBS를 사용했을 때 세포 생존율의 명확한 차이는 관찰되지 않았습니다. 동결 보존 기간(최대 1년)의 길이가 방사선 조사 및 비방사선 시료 모두에서 MN 수율에 영향을 미치지 않는다는 것이 그룹에 의해 검증되었습니다 6,8. 연구에 따르면 PBMC의 우수한 세포 생존율과 증식은 저온(액체 질소)에서 점진적으로 동결한 후10,11을 해동하는 동안 예열된 배지를 점진적으로 첨가하여 달성할 수 있습니다. 연구자들은 해동된 전혈에서 T-림프구의 하위 집단이 해동된 PBMC에서 관찰된 것과 비슷하다는 것을 보여주었다12. 또한, 냉동보존된 전혈 샘플로부터 회수된 세포 아형은 신선한 전혈 샘플에서 관찰된 것과 유사하다는 것이 입증되었다 13,14.
보고서에서 얻은 지표 결과를 검토하면 선량에 따른 선형 2차 증가(그림 3)가 선형 에너지 전달(LET) 유도 소핵15,16에 대한 다른 문헌 보고서와 일치함을 알 수 있습니다. 냉동 보존된 전혈 샘플(표 1)에서 관찰된 MN 수율의 변동성은 신선한 전혈 배양에 대해 보고된 것과 범위 내에 있습니다 8,17,18. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 20명의 건강한 지원자의 신선하고 냉동 보존된 전혈에서 검증되었습니다8. 이 보고서에서 관찰된 세포 증식의 중요한 매개변수인 핵 분열 지수(NDI)는 신선한 전혈19,20에 대해 제안된 것과 일치했다. 종합하면, 전혈 및 변형된 소핵 분석의 최적화된 동결 보존 프로토콜은 더 나은 세포 수율을 제공하므로 방사선 민감도 평가에 이 프로토콜의 적응이 권장됩니다. 프로토콜의 재현성은 이미 검증되었기 때문에8, 대규모 및 다기관 연구에 적용할 수 있는 것이 제안된다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 기술 지원에 대해 L. Pieters, T. Thiron 및 G. De Smet에게 감사의 뜻을 전합니다. 연구를 위해 헌혈해 주신 모든 자원 봉사자들에게 감사드립니다. 이 연구는 그랜트(T000118N)가 이끄는 플랑드르 연구재단(FWO)의 재정 지원을 받았다.
15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |