Dondurularak Saklanmış Tam Kan Üzerinde Mikronükleus Testi

Bu çalışma için, yaşları 17 ile 65 arasında değişen 30 sağlıklı donörden damar delinmesi yoluyla kan örnekleri toplandı. 20 bağışçıdan elde edilen MN verileri, Beyls ve ark.8 Kan örneklerinin toplanması, Belçika’daki Ghent Üniversite Hastanesi Etik Kurulu’nun (kayıt numarası: 2019/1565) yönergelerine uygundur. Tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. 1. Kan örneklerinin toplanması Başlamadan önce, katılımcıların yazılı bilgilendirilmiş onamının mevcut olduğundan ve etik yönergelere uygun şekilde uyulduğundan emin olun. Kanı Li-Heparin tüplerine toplayın ve kriyoprezervasyon için işlenmeye hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. 2. Tam kanın dondurularak saklanması NOT: Hücre toplamaya kadar olan tüm adımlar steril laminer hava akışında aseptik olarak gerçekleştirilir. 1 mL kanı dondurarak saklamak için, 800 μL Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve 200 μL dimetil sülfoksiti (DMSO) karıştırarak 1 mL dondurma ortamı yapın.NOT: Dondurma ortamı, dondurulması gereken kan örneklerine eşit hacimde hazırlanır. Tam kanın dondurularak saklanması için, kan örneğini heparinize tüpten 15 veya 50 mL’lik santrifüj tüplerine aktarınNOT: Tüpün kapasitesi kanın hacmine bağlıdır. Kanı, eşit hacimde donma ortamının sürekli ancak damla damla eklenmesiyle düşük hızda vorteksleyin. 2 mL kan donma karışımını, her bir alikotun 1 mL dondurma karışımı ile karıştırılmış 1 mL kan örneğine sahip olduğu kriyoviyallere (2 mL) aktarın. Kademeli kademeli dondurmaKriyovialleri izopropanol içeren bir kriyobox’a aktarın ve gece boyunca bir dondurucuya (-80 °C) koyun. Kriyoviyalleri uzun süreli kullanım için sıvı nitrojene aktarın. 3. Dondurularak saklanmış kanın çözülmesi NOT: Çözdürme işleminin toplam süresini sınırlamak için, bir seferde maksimum 8 kriyovion (her biri 2 mL) kullanılmalıdır. HazırlıkKanı çözmeden önce 200 mL steril Fosfat tamponlu Salin’i (PBS) 37 °C’ye ısıtın. Steril koşullar altında gerekli kültür ortamının çalışma solüsyonunu hazırlayın. Kültür başına ortamın 1.6 mL tam ortam içerdiğinden emin olun: penisilin / streptomisin (% 0.5), 0.2 mL FCS, 20 μL sodyum piruvat ve 2 μL β-merkaptoetanol ile desteklenmiş Rosewell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) ortamı.NOT: Çözdürme sırasında önemli sayıda kan hücresi kaybolabileceğinden, çözülen kan, toplam hacmi 2 mL olan 24 oyuklu plakalar gibi küçük kuyucuklarda kültürlenir. Doz başına bir çok kuyulu plaka kullanılır. Her kültür kuyusu için, aşağıda önerildiği gibi donör kodunu ve A/B’yi tarih ve dozla birlikte kapakta belirtin (Şekil 1). Şekil 1: Mikronükleus testi için tam kanı kültürlemek için 24 oyuklu bir plakanın önerilen düzeni. Kuyucukları işaretleyin ve donör kodlarını kapakta uygun yerlerde belirtin. Her hasta numunesi için, çift kuyucuklar birbirine bitişik olmalıdır. 10 x 10 kolimatör için düşündürücü bir düzen olduğunu ve kolimatörün veya numunelerin boyutuna göre değiştirilebileceğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tam kanın çözülmesi ve kültürlenmesi için adımlarSu banyosunu 37 °C’ye ısıtın. Gerekli kriyoviyalleri sıvı nitrojenden çıkarın (sayı, doz sayısı gibi gereksinimlere bağlıdır).NOT: Bir kriyoviyal 1 mL kan ve 1 mL donma ortamı içerir. Bu nedenle, bir kriyoviyalden alınan kanla iki kültür kurulabilir. Kriyoviyalleri ılık su banyosunda kısmen çözün (küçük buz kristalleri hala görülene kadar). Şişeleri su banyosundan çıkarın ve şişelerin dışını steril kağıt mendille temizleyin. Steril bir laminer hava akımı başlığında, tüplerin içinde oluşan hava kabarcıklarının dökülmesini önlemek için şişeleri çok yavaş açın. Her bir şişenin içeriğini yeniden süspanse edin ve bunları ayrı ayrı 15 mL’lik bir konik santrifüj tüpüne (şişe başına 1 tüp) aktarın. İlgili tüplere, tüpü hafifçe döndürürken damla damla 1 mL ılık (37 °C) PBS ekleyin. Bir P1000 pipeti ile tekrar süspanse edin. Seyreltme ve homojen yıkama için, damla damla 7 mL önceden ısıtılmış PBS (37 °C) ekleyin ve bir P1000 pipeti ile yeniden süspanse edin. Kanı oda sıcaklığında 180 × g’da ( hızlanma 1, fren 1’de) 8 dakika santrifüj edin. Bu bekleme adımı sırasında, boş kuyucukları (hücrelerin kültürleneceği yer dışında) 500 μL PBS ile doldurun. Ön ısıtmak için kuyu plakalarını inkübatöre geri yerleştirin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, hücre peletini bozmamak için yaklaşık 1 mL geride bırakarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Kalan süpernatanttaki peleti bir P1000 pipeti ile yeniden süspanse edin. Tüpleri hafifçe döndürürken ilgili tüplere damla damla 8 mL ılık PBS (37 °C) ekleyin. Daha sonra bir P1000 pipeti ile tekrar süspanse edin. Yeniden süspanse edilen kanı 8 dakika boyunca 180 × g’da santrifüjleyin ( hızlanma 9, fren 9’da ayarlanarak). Bu bekleme adımı sırasında, işaretli kuyucukların her birine 200 μL kültür ortamı aktarın. Plakaları 37 °C’de kalacak şekilde inkübatörde saklayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı sürekli bir hareketle çıkarın (gevşek hücre peletini rahatsız etmemek için), ancak yaklaşık 80 μL süpernatanı geride bırakın. Pelet’e 280 μL FCS (oda sıcaklığı) ekleyin ve yeniden süspanse edin (toplam 360 μL hacme). Her bir kuyucuğa 180 μL hücre süspansiyonu aktarın ve yeniden süspanse edin (= 0.5 mL “kan”/kültür). Her bir kuyucudaki toplam hacim artık 380 μL’dir ve bu da 2 mm’lik bir orta tabaka ile sonuçlanır. Plakaları ışınlamadan önce en az 10 dakika boyunca 37 ° C’de bir CO2 inkübatörde inkübe edin. 4. G0 MN testi Plakaları inkübatörden çıkarın ve hücre kültürünü oda sıcaklığında 0.5, 1 ve 2 Gy X-ışınları (220 kV, 13 mA, 0.15 mm Cu) gibi gerekli dozlarla ışınlayın. Spontan MN verimlerini belirlemek için sahte ışınlanmış numuneleri kontrol olarak kullanın. Işınlamadan hemen sonra, her bir oyuğa 1.62 mL kültür ortamı (37 °C) ekleyin. T-lenfositlerde hücre bölünmesini uyarmak için, her bir oyuğa 40 μL Fitohemaglutinin (PHA) ekleyin ve iyice yeniden süspanse edin. Bu plakaları inkübatöre geri yerleştirin (O2, 37 °C).NOT: Bu, tahlilin başlangıç zamanı olacaktır. Oyuk başına 8 μL sitokalasin B (6 μg / mL) ekleyerek stimülasyondan 23 saat sonra sitokinezi bloke edin ve uygun şekilde yeniden süspanse edin. Hücre kültürlerini stimülasyon/kültür süresinden 70 saat sonra hasat edin. Hücreleri yeniden askıya alın ve 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Her bir kuyuyu 2 mL PBS ile durulayın ve bu PBS’yi ilgili 15 mL tüpe ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 180 × g’da 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ancak peletin üzerinde yaklaşık 500 μL bırakın. Peletleri vorteksleyin (tam hızda) ve girdap yaparken yavaşça damla damla 2 mL soğuk potasyum klorür (KCl, 4 °C) ekleyin. Hücreleri hemen 180 × g’da 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, yaklaşık 500 μL süpernatan bırakın. Peletleri vorteksleyin (tam hızda) ve girdap yaparken yavaşça damla damla 2 mL soğuk fiksatif 1 (4:1:5 oranında Metanol/Asetik asit/Ringer çözeltisi) ekleyin. Numune tüplerini gece boyunca 4 °C’de bırakın (minimum 12 saat ve maksimum 96 saat). 180 × g’da 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peletleri vorteksleyin (tam hızda) ve vorteksleme sırasında yavaşça damla damla 2 mL soğuk fiksatif 2 (4:1 oranında metanol/asetik asit) ekleyin. 180 × g’da 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peletleri vorteksleyin (tam hızda) ve ardından yavaşça (damla damla) girdap yaparken pelete 2 mL soğuk fiksatif 2 ekleyin. Numune tüplerini 4 °C’de bırakın (minimum 12 saat ve maksimum 96 saat). Slaytları izopropanol ile temizleyin ve uygun şekilde etiketleyin.NOT: İşleme sırasında keçeli kalem mürekkebi kolayca silindiğinden, etiketlemek için basılı çıkartmalar kullanın. Numune tüplerini 180 × g’da 8 dakika santrifüjleyin. Hücreleri peletin boyutuna göre konsantre etmek için süpernatanı başka bir tüpe aktarın. Peleti girdaplayın. Sabit hücrelerin 40 μL’sini kuru ve temiz bir slayt üzerine bırakın. Slaytları oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Slaytları bir kutuda saklayın veya gözlem için hemen boyayın. 5. Akridin portakal (AO) boyama Slaytları 1 dakika AO boyasına batırın, ardından damıtılmış suda hızlı bir şekilde yıkayın ve ardından slaytları 1 dakika fosfat tamponuna (pH 6.8) yerleştirin. Slaytları tampon solüsyonundan ve temiz kağıt mendille çıkarın, slaytların arkasını kurutun ve slaytları temiz bir kağıt mendil üzerine koyun. Sürgünün üzerine 20 μL fosfat tamponu bırakın ve hava kabarcıklarını önleyerek temiz bir lamel ile nazikçe örtün. Bu slaytları silikon çimento ile kapatın.NOT: AO ışığa duyarlı olduğundan ve zamanla solduğundan, güzel bir kontrast ve floresan için, slaytların boyandıktan sonraki 5 gün içinde puanlanması önerilir. Slaytları muayene edilmediği zaman daima soğuk bir odada (4 °C) saklayın. 6. Lekeli slaytların puanlanması Slaytınızı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin ve 1.000 çift çekirdekli hücreyi (BN) inceleyin. Toksisitenin altı biyobelirtecinden biri olan MN’leri manuel olarak sayın. Bunu yapmak için, iki bağımsız puanlayıcının aynı büyütme altında 500 BN hücresini / slaytı incelemesini sağlayın.NOT: Aşağıda, Fenech tarafından lekeli slaytları puanlamak için önerilen puanlama kriterlerinin bazı önemli noktalarıverilmiştir 9Yaklaşık olarak aynı boyutta, düzenli şekle ve boyama desenine sahip iki iyi ayırt edilmiş çekirdeğe sahip, bozulmamış sitoplazmaya sahip güzel yuvarlak hücreler arayarak bir BN hücresi seçin. BN hücresinin sitoplazmasının, bitişik hücrenin sitoplazmasından ayırt edilebilir olduğundan emin olun. Morfolojik olarak ana çekirdeklerle aynı ancak ondan daha küçük olduğuna dikkat ederek bir MN puanlayın; en büyük MN bile ana çekirdeğin çapının 1/3’ünden fazla olamaz. Bir MN’yi yalnızca ana çekirdeğe dokunmuyorsa veya en azından mikronükleer sınır ana çekirdeğin sınırından ayırt edilebiliyorsa puanlayın.