Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.
Farelerden elde edilen kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM’ler), doku makrofajlarının karmaşık biyolojisini incelemek için önemli bir araçtır. Birincil hücreler olarak, makrofajların fizyolojisini in vivo olarak ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücre dizilerinden daha yakından modellerler ve halihazırda tanımlanmış genetik değişiklikleri taşıyan farelerden türetilebilirler. Bununla birlikte, BMDM’lerde gen fonksiyonunu bozmak teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Burada, BMDM’lerde verimli CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi için bir protokol sunuyoruz, bu da gen fonksiyonunu bozan çerçeve kayması mutasyonlarıyla sonuçlanan küçük eklemelerin ve delesyonların (indels) kullanılmasına izin veriyor. Protokol, tek kılavuzlu RNA’ların (sgRNA-Cas9) nasıl sentezleneceğini ve elektroporasyon yoluyla verilebilen saflaştırılmış sgRNA-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerinin (RNP’ler) nasıl oluşturulacağını açıklar. Ayrıca, rutin Sanger dizileme ve ücretsiz olarak kullanılabilen bir çevrimiçi analiz programı kullanarak düzenleme verimliliğini izlemek için etkili bir yöntem sağlar. Protokol 1 hafta içinde yapılabilir ve plazmit yapımı gerektirmez; Genellikle %85 ila %95 düzenleme verimliliği sağlar.
Makrofajlar, doku onarımı ve bağışıklıktakritik rol oynayan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir 1,2. Fare RAW 264.7 hücreleri veya insan THP-1 hücreleri gibi ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücre hatları, RNA girişimi veya CRISPR/Cas9 3,4 için vektörler sağlayarak sağlam büyüme ve gen bozulması kolaylığı dahil olmak üzere çeşitli faydalı özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, onkojenik transformasyon fizyolojilerini önemli ölçüde değiştirir, bu da bazı yolların anormal aktivasyonuna ve diğerlerinin sessiz tepkilerine neden olur 5,6. Primer kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM’ler) in vivo makrofaj fizyolojisini daha yakından özetler, ancak bu primer immün hücrelerde hem plazmit transfeksiyonunun hem de viral transdüksiyonun düşük etkinliği nedeniyle genetik olarak manipüle edilmesi zor olmaya devam etmektedir 7,8. Bu nedenle, gen fonksiyonunu bozmak için daha verimli yöntemlere ihtiyaç vardır.
CRISPR/Cas9 genom düzenleme, memeli hücreleri 9,10,11,12 dahil olmak üzere bir dizi biyolojik sistemde genetik manipülasyon için güçlü bir araçtır. Streptococcus pyogenes Cas9 proteini, diziye özgü bir kılavuz RNA ile kompleks haline getirildiğinde çift sarmallı DNA’yı verimli ve spesifik olarak parçalar. Bölünmüş DNA’nın homolog olmayan uç birleşmesi (NHEJ) yoluyla DNA onarımı, çerçeve kayması mutasyonları oluşturan küçük eklemeler veya delesyonlar (indels) ile sonuçlanır. Erken çalışmalarda, Cas9 ve sgRNA’lar, birçok hücre hattı için etkili dağıtım yöntemleri olan plazmit veya lentiviral vektörler yoluyla verildi 9,10. Bununla birlikte, birincil hücreler ve özellikle birincil bağışıklık hücreleri, transfeksiyon veya transdüksiyon yoluyla vektör iletiminin düşük verimliliği nedeniyle genellikle bu yöntemlere dirençlidir. Daha sonra, in vitro olarak sgRNA-Cas9 kompleksleri oluşturmak ve bunları elektroporasyon yoluyla vermek için yöntemler geliştirilmiş ve bu yöntemler çeşitli hücre tiplerinde yüksek verimlilik sağlamıştır13,14. Sonuçlar, primer makrofajlarda genom düzenlemesi yapmak için bu yaklaşımı kullanma olasılığını ortaya koymuştur.
Burada, birincil BMDM’lerde genom düzenlemesi yapmak için sgRNA-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerini (RNP’ler) kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Birincil bağışıklık hücrelerinde bulunan bağışıklık sensörlerinin aktivasyonunu azaltmak için adımlar içerir ve minimum toksisite ile hedeflenen lokuslarda %95’e kadar düzenleme ile sonuçlanır. Bu protokol aynı zamanda rutin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve Sanger dizilemesi kullanarak düzenleme verimliliğini değerlendirmek için iş akışlarını ve ardından iyi doğrulanmış bir çevrimiçi yazılım aracı olan Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15 ile in silico analizi içerir.
Elektroporasyonlu Cas9-sgRNA kompleksleri kullanılarak genom düzenleme, BMDM’lerde gen fonksiyonunun etkili bir şekilde bozulmasına izin verir. Düzenleme verimliliği, hedef diziye ve gene göre değişir. Tipik olarak, dört ila beş sgRNA, oldukça aktif olanı belirlemek için genellikle taranır. Bazı lokuslar, büyük olasılıkla kromatin yapısı nedeniyle daha düşük düzenleme verimliliğine sahiptir. Bu durumlarda, düzenleme verimliliğini artırmak için çeşitli değişiklikler yapılabilir. İki ak…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH hibesi 5R01AI144149 tarafından finanse edilmiştir. Şematik şekiller BioRender ile oluşturulmuştur.
3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
DNase | NEB | M0303S | |
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
ExoI | NEB | M0293S | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
RNA loading dye | NEB | B0363S | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
SAP | NEB | M0371S |