Özet

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

Published: August 04, 2023
doi:

Özet

このプロトコルは生体 外で 組み立てられ、electroporationによって渡されるCas9-sgRNAのribonucleoproteinの複合体を使用してマウス骨髄得られたマクロファージのゲノム編集のためのプロシージャを記述する。

Abstract

マウス由来の骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、組織マクロファージの複雑な生物学を研究するための重要なツールです。初代細胞として、不死化マクロファージ細胞株よりもin vivo でのマクロファージの生理機能を忠実にモデル化し、すでに定義された遺伝的変化を持つマウスに由来することができます。しかし、BMDMの遺伝子機能を破壊することは、依然として技術的に困難である。ここでは、遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす小さな挿入および欠失(インデル)の導入を可能にする、BMDMにおける効率的なCRISPR/Cas9ゲノム編集のプロトコルを提供します。プロトコルは単一ガイドRNA (sgRNA-Cas9)を総合し、electroporationによって渡すことができる浄化されたsgRNA-Cas9のribonucleoproteinの複合体(RNPs)を形作る方法を記述する。また、ルーチンのサンガーシーケンシングと無料で入手できるオンライン分析プログラムを使用して、編集効率を監視するための効率的な方法も提供します。プロトコルは1週間以内に実施でき、プラスミド構築は必要ありません。通常、85%から95%の編集効率が得られます。

Introduction

マクロファージは、組織の修復と免疫に重要な役割を果たす自然免疫細胞です1,2。マウスRAW 264.7細胞やヒトTHP-1細胞などの不死化マクロファージ細胞株は、RNA干渉またはCRISPR/Cas9 3,4用のベクターを送達することによる、堅牢な増殖や遺伝子破壊の容易さなど、いくつかの有益な特性を持っています。しかし、発がん性形質転換はそれらの生理機能を劇的に変化させ、その結果、いくつかの経路の異常な活性化と他の経路の応答の抑制が生じます5,6。初代骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、in vivoマクロファージの生理機能をより厳密に再現しているがこれらの初代免疫細胞におけるプラスミドトランスフェクションとウイルス形質導入の両方の効率が低いため、遺伝子操作は依然として困難である7,8したがって、遺伝子機能を破壊するためのより効率的な方法が必要です。

CRISPR/Cas9ゲノム編集は、哺乳類細胞を含むさまざまな生物学的システムにわたる遺伝子操作のための強力なツールである9,10,11,12化膿連鎖球菌Cas9タンパク質は、配列特異的なガイドRNAと複合体を形成すると、二本鎖DNAを効率的かつ特異的に切断します。切断されたDNAの非相同末端結合(NHEJ)によるDNA修復は、フレームシフト変異を引き起こす小さな挿入または欠失(インデル)をもたらします。初期の研究では、Cas9とsgRNAはプラスミドまたはレンチウイルスベクターを介して送達され、これらは多くの細胞株に効果的な送達方法である9,10。しかし、初代細胞、特に初代免疫細胞は、トランスフェクションまたは形質導入によるベクター送達の効率が低いため、これらの方法に抵抗性を示すことがよくあります。その後、in vitroでsgRNA-Cas9複合体を作製し、エレクトロポレーションを介して送達する方法が開発され、これらの方法はさまざまな細胞タイプで高効率を達成しています13,14。この結果は、このアプローチを用いて初代マクロファージのゲノム編集を行う可能性を示唆しています。

ここでは、sgRNA-Cas9リボ核タンパク質複合体(RNP)を使用して一次BMDMでゲノム編集を行うためのプロトコルを提供します。これには、初代免疫細胞に存在する免疫センサーの活性化を緩和する手順が含まれており、最小限の毒性で標的遺伝子座で最大95%の編集が可能です。このプロトコルには、ルーチンのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびサンガーシーケンシングを使用して編集効率を評価するワークフローも含まれており、その後、十分に検証されたオンラインソフトウェアツールである分解によるインデルの追跡(TIDE)15によるin silico分析が行われます。

Protocol

1. sgRNAの設計 注:このステップでは、標的配列の選択とsgRNAの設計について説明します。最初の大きなコードエクソンにあるガイドを設計することは、翻訳されたタンパク質がオープンリーディングフレームの早い段階で破壊されるようにするのに役立ちます。また、同じエクソン内にあるターゲット配列を選択することで、編集効率の解析が効率化されます(?…

Representative Results

IVT テンプレートは 127 bp の PCR 産物です(図 1B)。完全長IVT産物は98 nt RNAで、70 bpの二本鎖DNA断片と同様に遊走します(図1C)。 エレクトロポレーション後、細胞は>90%生存可能であり、総細胞数は開始細胞数の>70%である必要があります。結果として生じる変異細胞のプールは、Cas9切断部位の近くから始まる多様なインデルのセット?…

Discussion

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いたゲノム編集は、BMDMの遺伝子機能を効果的に破壊することを可能にします。編集効率は、標的配列や遺伝子によって異なります。典型的には、4〜5個のsgRNAをスクリーニングして、活性の高いものを同定する。一部の遺伝子座は編集効率が低く、おそらくクロマチン構造が原因です。このような場合は、編集効率を高めるためにいくつかの変更を?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIHの助成金5R01AI144149によって資金提供されました。回路図はBioRenderで作成しました。

Materials

3T3-MCSF Cell Line Gift from Russell Vance not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer IDT 1075915
Ampure XP Reagent Beads Beckman Coulter A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase NEB M0525S
DNase NEB M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) Thermo Fisher 14040-133
DPBS -Ca/Mg Thermo Fisher 14190-144
ExoI NEB M0293S
Fetal Calf Serum (FCS) Corning 35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer Agilent 600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit NEB E2040S
LoBind conical tubes 15 mL Eppendorf 30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL Eppendorf 22431102
NEBuffer r2.1 NEB B6002S
Neon Transfection System Thermo Fisher MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips Thermo Fisher MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA Lonza BE02017F
Proteinase K Thermo Fisher EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI NEB B6004S
Ribolock Thermo Fisher EO0384
RNA loading dye NEB B0363S
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
S. pyogenes Cas9-NLS University of California Macro Lab not applicable Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation IDT 1081059
SAP NEB M0371S

Referanslar

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