Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées qui jouent un rôle essentiel dans la réparation des tissus et l’immunité ^1,2. Les lignées cellulaires de macrophages immortalisées, telles que les cellules RAW 264.7 de souris ou les cellules humaines THP-1, présentent plusieurs caractéristiques bénéfiques, notamment une croissance robuste et une facilité de perturbation génique en délivrant des vecteurs d’interférence ARN ou CRISPR/Cas9 ^3,4. Cependant, la transformation oncogénique modifie considérablement leur physiologie, ce qui se traduit par l’activation aberrante de certaines voies et des réponses atténuées d’autres ^5,6. Les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse (BMDM) récapitulent plus étroitement la physiologie des macrophages in vivo, mais restent difficiles à manipuler génétiquement en raison de la faible efficacité de la transfection plasmidique et de la transduction virale dans ces cellules immunitaires primaires ^7,8. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes plus efficaces pour perturber la fonction des gènes.

L’édition du génome CRISPR/Cas9 est un outil puissant pour la manipulation génétique dans une gamme de systèmes biologiques, y compris les cellules de mammifères 9,10,11,12. La protéine Cas9 de Streptococcus pyogenes clive efficacement et spécifiquement l’ADN double brin lorsqu’elle est complexée avec un ARN guide spécifique à la séquence. La réparation de l’ADN par la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) de l’ADN clivé entraîne de petites insertions ou délétions (indels) qui créent des mutations de décalage de cadre. Dans les premières études, Cas9 et les ARNsg ont été administrés par des vecteurs plasmides ou lentiviraux, qui sont des méthodes d’administration efficaces pour de nombreuses lignées cellulaires ^9,10. Cependant, les cellules primaires et, en particulier, les cellules immunitaires primaires sont souvent réfractaires à ces méthodes en raison de la faible efficacité de l’administration du vecteur par transfection ou transduction. Par la suite, des méthodes ont été développées pour générer des complexes ARNsg-Cas9 in vitro et les délivrer par électroporation, et ces méthodes ont atteint une grande efficacité dans une variété de types de cellules^13,14. Les résultats ont suggéré la possibilité d’utiliser cette approche pour effectuer l’édition du génome dans les macrophages primaires.

Ici, nous fournissons un protocole pour l’utilisation des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) sgRNA-Cas9 pour effectuer l’édition du génome dans les BMDM primaires. Il contient des mesures pour atténuer l’activation des capteurs immunitaires présents dans les cellules immunitaires primaires et permet d’éditer jusqu’à 95 % des loci ciblés avec une toxicité minimale. Ce protocole comprend également des flux de travail permettant d’évaluer l’efficacité de l’édition à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de routine et du séquençage de Sanger, suivis d’une analyse in silico par Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)¹⁵, un outil logiciel en ligne bien validé.