Disrupción génica de alta eficiencia en macrófagos primarios derivados de la médula ósea mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados

Los macrófagos son células inmunitarias innatas que desempeñan un papel fundamental en la reparación de tejidos y la inmunidad ^1,2. Las líneas celulares de macrófagos inmortalizadas, como las células RAW 264.7 de ratón o las células THP-1 humanas, tienen varias características beneficiosas, incluido el crecimiento robusto y la facilidad de disrupción génica mediante la administración de vectores de interferencia de ARN o CRISPR/Cas9 ^3,4. Sin embargo, la transformación oncogénica altera drásticamente su fisiología, lo que resulta en la activación aberrante de algunas vías y respuestas silenciadas de otras ^5,6. Los macrófagos primarios derivados de la médula ósea (DMO) recapitulan más fielmente la fisiología de los macrófagos in vivo, pero siguen siendo difíciles de manipular genéticamente debido a la baja eficiencia tanto de la transfección de plásmidos como de la transducción viral en estas células inmunitarias primarias ^7,8. Por lo tanto, se necesitan métodos más eficientes para interrumpir la función de los genes.

La edición del genoma CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta para la manipulación genética en una variedad de sistemas biológicos, incluidas las células de mamíferos 9,10,11,12. La proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes escinde de manera eficiente y específica el ADN bicatenario cuando se compleja con un ARN guía específico de secuencia. La reparación del ADN a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) del ADN escindido da lugar a pequeñas inserciones o deleciones (indels) que crean mutaciones de cambio de marco. En los primeros estudios, Cas9 y sgRNAs se administraron a través de plásmidos o vectores lentivirales, que son métodos de administración efectivos para muchas líneas celulares ^9,10. Sin embargo, las células primarias y, en particular, las células inmunitarias primarias suelen ser refractarias a estos métodos debido a la baja eficacia de la administración del vector por transfección o transducción. Posteriormente, se han desarrollado métodos para generar complejos sgRNA-Cas9 in vitro y administrarlos por electroporación, y estos métodos han logrado una alta eficiencia en una variedad de tipos celulares^13,14. Los resultados han sugerido la posibilidad de utilizar este enfoque para llevar a cabo la edición genómica en macrófagos primarios.

Aquí, proporcionamos un protocolo para el uso de complejos de ribonucleoproteínas (RNP) sgRNA-Cas9 para llevar a cabo la edición del genoma en BMDM primarios. Contiene medidas para mitigar la activación de los sensores inmunitarios presentes en las células inmunitarias primarias y da como resultado una edición de hasta el 95% en loci específicos con una toxicidad mínima. Este protocolo también incluye flujos de trabajo para evaluar la eficiencia de la edición mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) rutinaria y la secuenciación de Sanger, seguida de un análisis in silico mediante el seguimiento de Indels por descomposición (TIDE)¹⁵, una herramienta de software en línea bien validada.