Hocheffiziente Genzerstörung in primären Makrophagen aus dem Knochenmark unter Verwendung elektroporierter Cas9-sgRNA-Komplexe
Özet
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Genom-Editierung in aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Makrophagen unter Verwendung von Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexen, die in vitro zusammengesetzt und durch Elektroporation verabreicht werden.
Abstract
Aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMDMs) von Mäusen sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der komplexen Biologie von Gewebemakrophagen. Als Primärzellen modellieren sie die Physiologie von Makrophagen in vivo genauer als immortalisierte Makrophagen-Zelllinien und können von Mäusen abgeleitet werden, die bereits definierte genetische Veränderungen tragen. Die Störung der Genfunktion in BMDMs ist jedoch nach wie vor eine technische Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll für die effiziente CRISPR/Cas9-Genom-Editierung in BMDMs zur Verfügung, das die Einführung kleiner Insertionen und Deletionen (Indels) ermöglicht, die zu Frameshift-Mutationen führen, die die Genfunktion stören. Das Protokoll beschreibt, wie Single-Guide-RNAs (sgRNA-Cas9) synthetisiert und gereinigte sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe (RNPs) gebildet werden, die durch Elektroporation verabreicht werden können. Es bietet auch eine effiziente Methode zur Überwachung der Bearbeitungseffizienz mithilfe der routinemäßigen Sanger-Sequenzierung und eines frei verfügbaren Online-Analyseprogramms. Das Protokoll kann innerhalb von 1 Woche durchgeführt werden und erfordert keine Plasmidkonstruktion; Dies führt in der Regel zu einer Bearbeitungseffizienz von 85 % bis 95 %.
Introduction
Makrophagen sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die eine entscheidende Rolle bei der Gewebereparatur und Immunität spielen 1,2. Immortalisierte Makrophagen-Zelllinien, wie z. B. RAW 264.7-Zellen der Maus oder menschliche THP-1-Zellen, haben mehrere vorteilhafte Eigenschaften, darunter robustes Wachstum und einfache Genstörung durch die Bereitstellung von Vektoren für RNA-Interferenz oder CRISPR/Cas9 3,4. Die onkogene Transformation verändert jedoch dramatisch ihre Physiologie, was zu einer abnormen Aktivierung einiger Signalwege und zu gedämpften Reaktionen anderer führt 5,6. Primäre aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) rekapitulieren die Physiologie der Makrophagen in vivo genauer, sind aber aufgrund der geringen Effizienz sowohl der Plasmidtransfektion als auch der viralen Transduktion in diesen primären Immunzellen nach wie vor schwierig genetisch zu manipulieren 7,8. Daher werden effizientere Methoden zur Störung der Genfunktion benötigt.
Die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genetischen Manipulation in einer Reihe biologischer Systeme, einschließlich Säugetierzellen 9,10,11,12. Das Cas9-Protein von Streptococcus pyogenes spaltet effizient und spezifisch doppelsträngige DNA, wenn es mit einer sequenzspezifischen Leit-RNA komplexiert wird. Die DNA-Reparatur durch die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) der gespaltenen DNA führt zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels), die Frameshift-Mutationen erzeugen. In frühen Studien wurden Cas9 und sgRNAs über Plasmid- oder lentivirale Vektoren verabreicht, die für viele Zelllinien effektive Verabreichungsmethoden darstellen 9,10. Primärzellen und insbesondere primäre Immunzellen sind jedoch aufgrund der geringen Effizienz der Vektorverabreichung durch Transfektion oder Transduktion oft refraktär gegenüber diesen Methoden. In der Folge wurden Methoden entwickelt, um sgRNA-Cas9-Komplexe in vitro zu erzeugen und über Elektroporation zu verabreichen, und diese Methoden haben in einer Vielzahl von Zelltypen eine hohe Effizienz erreicht13,14. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Ansatz für die Genom-Editierung in primären Makrophagen verwendet werden kann.
Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von sgRNA-Cas9-Ribonukleoproteinkomplexen (RNPs) zur Durchführung von Genom-Editierung in primären BMDMs zur Verfügung. Es enthält Schritte, um die Aktivierung der in primären Immunzellen vorhandenen Immunsensoren zu mildern, und führt zu einer bis zu 95%igen Editierung an Zielorten mit minimaler Toxizität. Dieses Protokoll umfasst auch Arbeitsabläufe zur Bewertung der Bearbeitungseffizienz mithilfe der routinemäßigen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der Sanger-Sequenzierung, gefolgt von der In-silico-Analyse durch Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, ein gut validiertes Online-Software-Tool.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Genom-Editierung mit elektroporierten Cas9-sgRNA-Komplexen ermöglicht eine effektive Störung der Genfunktion in BMDMs. Die Editiereffizienz variiert je nach Zielsequenz und Gen. In der Regel werden vier bis fünf sgRNAs gescreent, um eine hochaktive zu identifizieren. Einige Loci weisen eine geringere Editiereffizienz auf, was höchstwahrscheinlich auf die Chromatinstruktur zurückzuführen ist. In diesen Fällen können mehrere Änderungen vorgenommen werden, um die Bearbeitungseffizienz zu erhöhen. Die gleichzei…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium 5R01AI144149 finanziert. Die schematischen Abbildungen wurden mit BioRender erstellt.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
Referanslar
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