Özet

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Published: June 08, 2022
doi:

Özet

S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini S1P reseptörleri (S1PR’ler) alt ailesi aracılığıyla uygular. Burada, S1PR’lerin yapılarını ve işlevlerini açıklamak için bir boru hattı açıklanmaktadır.

Abstract

Lizofosfolipitler (LPL’ler), sfengozin 1-fosfat (S1P), lizofosfatidik asit vb. İçeren biyoaktif lipitlerdir. Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan S1P, sfengozin 1-fosfat reseptörlerinin (S1PR’ler) aracılık ettiği sinyal yolları aracılığıyla çeşitli hücresel fizyolojik yanıtları düzenleyen en iyi karakterize LPL’lerden biridir. Bu, S1P-S1PR sinyal sisteminin, multipl skleroz (MS), otoimmün bozukluklar, kanser, inflamasyon ve hatta COVID-19 dahil olmak üzere bozukluklar için dikkate değer bir potansiyel terapötik hedef olduğunu göstermektedir. A sınıfı G-protein eşleşmiş reseptör (GPCR) ailesinin küçük bir alt kümesi olan S1PR’ler beş alt tipten oluşur: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 ve S1PR5. Bununla birlikte, ayrıntılı yapısal bilgi eksikliği, S1PR’leri hedef alan ilaç keşfini engellemektedir. Burada, S1P-S1PR kompleksinin yapısını çözmek için kriyo-elektron mikroskobu yöntemini uyguladık ve hücre bazlı fonksiyonel tahliller kullanarak aktivasyon, seçici ilaç tanıma ve G-protein eşleşmesi mekanizmasını aydınlattık. Diğer lizofosfolipid reseptörleri (LPLR’ler) ve GPCR’ler de bu strateji kullanılarak incelenebilir.

Introduction

Hücre zarındaki sfengolipidlerin metabolik bir ürünü olan Sfengosin-1-fosfat (S1P), lenfosit kaçakçılığı, vasküler gelişim, endotel bütünlüğü ve kalp atış hızı 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik aktiviteleri içeren her yerde bulunan bir lizofosfatidik sinyal molekülüdür. S1P, çeşitli fizyolojik etkilerini beş S1P reseptör alt tipi (S1PRs 1-5) aracılığıyla uygular; S1PR’ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri için benzersiz tercihler sergiler 4,5. S1PR1 öncelikle daha sonra cAMP üretimini inhibe eden Gi proteini ile birleştirilir; S1PR2 ve S1PR3, Gi, Gq ve G12/13 ile birleştirilir ve S1PR4 ve S1PR5, Gi ve G12/136 üzerinden sinyal dönüştürür.

S1P-S1PR sinyalizasyonu, otoimmün bozukluklar7, inflamasyon8, kanser 9 ve hatta COVID-1910 dahil olmak üzere birçok hastalık için kritik bir terapötik hedeftir. 2010 yılında, fingolimod (FTY720), nüks multipl sklerozu (MS) 11’i tedavi etmek için S1PR’leri hedefleyen birinci sınıf bir ilaç olarak lisanslanmıştır. Bununla birlikte, S1PR2 hariç tüm S1PR’lere bağlanabilirken, S1PR3’e spesifik olmayan bağlanma, serebral korteksin ödemi, vasküler ve bronşiyal daralma ve akciğer epitel sızıntısı12 ile sonuçlanır. Terapötik seçiciliği arttırmak için alternatif bir strateji olarak, reseptör için alt tipe özgü ligandlar üretilmiştir. Siponimod (BAF312) 2019 yılında nüks MS tedavisi için onaylanmıştır13; S1PR1 ve S1PR5’i etkili bir şekilde hedeflerken, S1PR3 için afinitesi yoktur, klinik uygulamada daha az yan etki gösterir14. 2020 yılında, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, MS tedavisi için ozanimod’u yetkilendirdi15. Ozanimod’un S1PR1 için S1PR516’dan 25 kat daha fazla seçiciliğe sahip olduğu bildirilmiştir. Özellikle, mevcut COVID-19 pandemisi bağlamında, S1PR’leri hedef alan agonist ilaçların, immünomodülatör tedavi teknikleri kullanılarak COVID-19’u tedavi etmek için kullanılabileceği keşfedilmiştir17. Fingolimod ile karşılaştırıldığında, ozanimod COVID-19 hastalarında semptomları azaltmada üstünlük göstermiştir ve şimdi klinik çalışmalardan geçmektedir10. S1PR’lerin yapısal temelini ve işlevini anlamak, S1PR’ler18’i seçici olarak hedefleyen bir ilaç geliştirmek için önemli bir temel oluşturur.

X-ışını kristalografisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) ve elektron mikroskobu (EM) dahil olmak üzere biyomakromoleküllerin yapısal bilgilerini araştırmak için birçok teknik kullanılmaktadır. Mart 2022 itibariyle, Protein Veri Bankası’na (PDB) yatırılan 180.000’den fazla yapı var ve bunların çoğu X-ışını kristalografisi ile çözüldü. Bununla birlikte, Yifan Cheng ve David Julius tarafından 201319’da bildirilen TPRV1’in ilk atomik çözünürlüğe yakın yapısı (3.4 şçözünürlük) ile, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) protein yapıları için ana akım bir teknik haline gelmiştir ve EM PDB yapılarının toplam sayısı 10.000’den fazlaydı. Kritik atılım alanları, doğrudan elektron algılama kameraları ve yeni görüntü işleme algoritmaları olarak bilinen görüntüleme için yeni kameraların geliştirilmesidir. Cryo-EM, son on yılda yapı biyolojisinde ve yapı tabanlı ilaç keşfinde devrim yarattı20. Makromoleküler komplekslerin canlı hücredeki karmaşık rollerini nasıl yerine getirdiklerini anlamak, biyolojik bilimlerde merkezi bir tema olduğundan, kriyo-EM, özellikle transmembran proteinleri için dinamik moleküler komplekslerin konformasyonlarını ortaya çıkarma potansiyeline sahiptir21. G-protein eşleşmiş reseptörleri (GPCR’ler), transmembran proteinlerinin en büyük süper ailesidir ve şu anda pazarlanan ilaçların% 30’undan fazlasının hedefleridir22. Kriyo-EM’nin gelişimi, GPCR-G protein komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapılarının patlamasına katkıda bulunarak, ilaç tasarımında X-ışını kristalografik analizi için hala erişilemeyen ‘inatçı’ hedefler için yapısal belirlemeyi mümkün kılmıştır23. Bu nedenle, kriyo-EM uygulaması, GPCR’lerin üç boyutlu yapısını, atomik çözünürlük24’e yakın doğal koşullarda belirleme şansı sağlar. Kriyo-EM’deki ilerlemeler, GPCR stimülasyonunun veya inhibisyonunun mekanik temellerini görselleştirmeyi mümkün kılmakta ve GPCR hedefli ilaç üretimi için yeni bağlanma bölgelerinin ortaya çıkarılmasında daha fazla fayda sağlamaktadır25.

Kriyo-EM teknolojisinin muazzam adımlarına dayanarak, son zamanlarda26,27 olan acı çeken S1PR1-, S1PR3- ve S1PR5-Gi sinyal komplekslerinin yapılarını belirledik. İnsanlarda, S1PR’ler çeşitli dokularda bulunur ve aşağı akış G proteinleri 4,5 için benzersiz tercihler sergiler. S1PR1 öncelikle Gi proteini ile birleştirilir ve bu da daha sonra 3′,5′-siklik adenozin monofosfat (cAMP) üretimini inhibe eder. S1PR3 ve S1PR5 ayrıca Gi 6,28 ile birleşebilir. Gi-kuplajlı reseptör aktivasyonu cAMP29’un üretimini azalttığından, fonksiyonel değişiklikleri yakalamak için cAMP inhibisyon etkilerini ölçmek için bir Gi-inhibisyon cAMP testi tanıtıldı26,27. Bir cAMP bağlayıcı protein parçasının yerleştirildiği Photinus pyralis luciferase’in mutant bir versiyonunu kullanarak, bu cAMP testi, hücre içi cAMP konsantrasyonundaki değişiklikler yoluyla GPCR aktivitesini izlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sunar30. Hassas ve radyoaktif olmayan fonksiyonel bir testtir ve ilaç keşfi amacıyla çok çeşitli GPCR’lerin gerçek zamanlı aşağı akış sinyalizasyonunu izlemek için uygulanabilir31.

Burada, öncelikle kriyo-EM manipülasyonları ve bir Gi-inhibisyon cAMP testi dahil olmak üzere, S1PR’lerin aktivasyon ve ilaç tanıma modlarının çözümünde kritik yöntemlerin bir özeti verilmiştir. Bu makale, GPCR’lerin yapı ve işlevlerine yönelik daha ileri araştırmalar için kapsamlı deneysel rehberlik sağlamayı amaçlamaktadır.

Protocol

1. S1PRs-G protein kompleksinin saflaştırılması İnsan S1PR’leri-G protein kompleksini saflaştırmak için, C-terminal kalıntıları 338-382’den yoksun olan S1PR1’in cDNA’larını, C-terminus’ta 345-398 ile kesilmiş vahşi tip S1PR3, S1PR5’i ve vahşi tip Gi1’i pFastBac1 vektörüne ve vahşi tip Gβ1 ve Gγ2’nin cDNA’larını pFastBacdual vektörüne (Malzeme Tablosu) klonlayın.NOT: S1PR’ler için tüm yapılar ayrıca haemagglutinin (HA) sinyal dizisini ve ardınd…

Representative Results

S1PRs-Gi kompleksinin numunesini dondurmadan önce, saflaştırılmış numunenin boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrılması ve jel filtrasyon kromatografisi ile analiz edilmesi gerekir. Şekil 2 , örnek olarak S1PR3-Gi kompleksini göstermektedir. Homojen GPCR-G protein kompleksinin tepe fraksiyonu genellikle boyut dışlama kromatografisinin ~ 10.5 mL’sinde bulunuyordu (Şekil 2A). S1PR3-Gi kompleksinin SDS sayfası analizi (Şe…

Discussion

Bu protokol, S1PR’lerin yapılarını kriyo-EM ile belirlemek ve Gi-aracılı cAMP inhibisyon testi ile S1PR’lerin aktivasyon gücünü ölçmek için birincil bir boru hattını açıklamaktadır. Bazı adımlar deneyin başarısı için çok önemlidir.

S1PRs-Gi kompleksini saflaştırmak için, virüsün kalitesine ve sf9 hücrelerinin sağlığına daha fazla dikkat edilmelidir. Reseptörün ekspresyonu, zayıf sf9 hücrelerinde önemli ölçüde azalır. Sf9 hü…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S1PRs-Gi kompleksinin verileri, Sichuan Üniversitesi’ndeki Batı Çin Cryo-EM Merkezi’nde ve Güney Bilim ve Teknoloji Üniversitesi’ndeki (SUSTech) Cryo-EM Merkezi’nde toplandı ve Sichuan Üniversitesi’ndeki Duyu Yüksek Performanslı Bilgi İşlem Merkezi’nde işlendi. Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı (32100965 L.C.’ye, 32100988 W.Y.’ye, 31972916 Z.S.’ye) ve Sichuan Üniversitesi tam zamanlı Doktora Sonrası Araştırma Fonu (2021SCU12003’ten L.C.’ye) tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

Referanslar

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O’Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3′,5′-monophosphate and guanosine cyclic 3′,5′-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

View Video