Una pipeline per studiare le strutture e le vie di segnalazione dei recettori della sfingosina 1-fosfato

La sfingosina-1-fosfato (S1P), un prodotto metabolico degli sfingolipidi nella membrana cellulare, è una molecola di segnalazione lisofosfatidica ubiquitaria che coinvolge varie attività biologiche, tra cui il traffico linfocitario, lo sviluppo vascolare, l’integrità endoteliale e la frequenza cardiaca ^1,2,3. S1P esercita i suoi diversi effetti fisiologici attraverso cinque sottotipi di recettori S1P (S1PRs 1-5); Le S1PR si trovano in una varietà di tessuti e mostrano preferenze uniche per le proteine G a valle ^4,5. S1PR1 è principalmente accoppiato con la proteina Gi, che successivamente inibisce la produzione di cAMP; S1PR2 e S1PR3 sono accoppiati con Gi, Gq e G12/13, e S1PR4 e S1PR5 trasducono il segnale attraverso Gi e G12/13⁶.

La segnalazione S1P-S1PR è un bersaglio terapeutico critico per molteplici malattie, tra cui i disturbi autoimmuni⁷, l’infiammazione⁸, il cancro⁹ e persino COVID-19¹⁰. Nel 2010, fingolimod (FTY720) è stato autorizzato come farmaco di prima classe mirato agli S1PR per il trattamento della sclerosi multipla recidivante (SM)¹¹. Tuttavia, è in grado di legarsi a tutti gli S1PR tranne S1PR2, mentre il legame non specifico a S1PR3 provoca edema della corteccia cerebrale, costrizione vascolare e bronchiale e perdita epiteliale polmonare¹². Come strategia alternativa per aumentare la selettività terapeutica, sono stati prodotti ligandi sottotipo-specifici per il recettore. Siponimod (BAF312) è stato approvato nel 2019 per il trattamento della SM recidivante¹³; si rivolge efficacemente a S1PR1 e S1PR5, mentre non ha affinità per S1PR3, mostrando meno effetti collaterali nella pratica clinica¹⁴. Nel 2020, la Food and Drug Administration degli Stati Uniti ha autorizzato ozanimod per la terapia della SM¹⁵. È stato riportato che ozanimod detiene una selettività 25 volte maggiore per S1PR1 rispetto a S1PR5¹⁶. In particolare, nel contesto dell’attuale pandemia di COVID-19, è stato scoperto che i farmaci agonisti che hanno come bersaglio le S1PR possono essere utilizzati per trattare COVID-19 utilizzando tecniche di terapia immunomodulatoria¹⁷. Rispetto a fingolimod, ozanimod ha mostrato superiorità nel ridurre i sintomi nei pazienti COVID-19 ed è ora in fase di sperimentazione clinica¹⁰. La comprensione delle basi strutturali e della funzione delle S1PR pone una base significativa per lo sviluppo di un farmaco che colpisca selettivamente le S1PR¹⁸.

Molte tecniche sono utilizzate per studiare le informazioni strutturali delle biomacromolecole, tra cui la cristallografia a raggi X, la risonanza magnetica nucleare (NMR) e la microscopia elettronica (EM). A partire da marzo 2022, ci sono più di 180.000 strutture depositate sulla Protein Databank (PDB) e la maggior parte di esse è stata risolta dalla cristallografia a raggi X. Tuttavia, con la prima struttura di risoluzione quasi atomica di TPRV1 (risoluzione 3,4 Å) riportata da Yifan Cheng e David Julius nel 2013¹⁹, la microscopia crioelettronica (crio-EM) è diventata una tecnica mainstream per le strutture proteiche e il numero totale di strutture PDB EM era superiore a 10.000. Le aree critiche di svolta sono lo sviluppo di nuove telecamere per l’imaging note come telecamere a rilevamento diretto di elettroni e nuovi algoritmi di elaborazione delle immagini. Cryo-EM ha rivoluzionato la biologia della struttura e la scoperta di farmaci basati sulla struttura nell’ultimo decennio²⁰. Poiché comprendere come i complessi macromolecolari svolgono i loro complicati ruoli nella cellula vivente è un tema centrale nelle scienze biologiche, la crio-EM ha il potenziale per rivelare conformazioni di complessi molecolari dinamici, in particolare per le proteine transmembrana²¹. I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) sono la più grande superfamiglia di proteine transmembrana e il bersaglio di oltre il 30% dei farmaci attualmente commercializzati²². Lo sviluppo della crio-EM ha contribuito a un’esplosione di strutture ad alta risoluzione di complessi proteici GPCR-G, consentendo la determinazione strutturale di bersagli “intrattabili” che non sono ancora accessibili all’analisi cristallografica a raggi X nella progettazione di farmaci²³. Quindi, l’applicazione crio-EM offre la possibilità di determinare la struttura tridimensionale dei GPCR in condizioni quasi native a una risoluzione atomica vicina a²⁴. I progressi nella crio-EM rendono possibile visualizzare le basi meccanicistiche della stimolazione o dell’inibizione della GPCR e ulteriori benefici nello scoprire i nuovi siti di legame per la creazione di farmaci mirati al GPCR²⁵.

Basandosi sugli enormi progressi della tecnologia crio-EM, abbiamo identificato strutture di complessi di segnalazione agonizzati S1PR1-, S1PR3- e S1PR5-Gi recentemente^26,27. Nell’uomo, gli S1PR si trovano in vari tessuti e mostrano preferenze uniche per le proteine G a valle ^4,5. S1PR1 è principalmente accoppiato con la proteina Gi, che successivamente inibisce la produzione di 3′,5′-adenosina monofosfato ciclico (cAMP). S1PR3 e S1PR5 sono anche in grado di accoppiarsi con Gi ^6,28. Poiché l’attivazione del recettore accoppiato a Gi diminuisce la produzione di cAMP²⁹, è stato introdotto un test di inibizione del cAMP per misurare gli effetti di inibizione del cAMP per catturare le alterazioni funzionali^26,27. Utilizzando una versione mutante di Photinus pyralis luciferasi in cui è stata inserita una porzione proteica legante il cAMP, questo test cAMP offre un metodo semplice e affidabile per monitorare l’attività GPCR attraverso cambiamenti nella concentrazione intracellulare di cAMP³⁰. Si tratta di un saggio funzionale sensibile e non radioattivo e può essere applicato per monitorare la segnalazione a valle in tempo reale di un’ampia gamma di GPCR ai fini della scoperta di farmaci³¹.

Qui, viene fornito un riepilogo dei metodi critici per risolvere le modalità di attivazione e riconoscimento dei farmaci di S1PR, includendo principalmente manipolazioni crio-EM e un test di inibizione Gi-cAMP. Questo articolo ha lo scopo di fornire una guida sperimentale completa per ulteriori esplorazioni nelle strutture e nelle funzioni dei GPCR.