Özet

스핑고신 1-인산염 수용체의 구조와 신호전달 경로를 조사하는 파이프라인

Published: June 08, 2022
doi:

Özet

S1P는 S1P 수용체(S1PRs) 서브패밀리를 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. 여기에서는 S1PR의 구조와 기능에 대해 설명하기 위해 파이프 라인에 대해 설명합니다.

Abstract

리소포스포지질(LPLs)은 스핑고신 1-포스페이트(S1P), 리소포스파티드산 등을 포함하는 생리활성 지질이다. 세포막에서 스핑고지질의 대사 산물인 S1P는 스핑고신 1-인산염 수용체(S1PRs)에 의해 매개되는 신호전달 경로를 통해 다양한 세포 생리적 반응을 조절하는 가장 특징적인 LPL 중 하나이다. 이것은 S1P-S1PRs 신호 전달 시스템이 다발성 경화증 (MS), 자가면역 장애, 암, 염증 및 심지어 COVID-19를 포함한 장애에 대한 주목할만한 잠재적 치료 표적임을 암시했다. 클래스 A G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 패밀리의 작은 서브세트인 S1PRs는 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5의 다섯 가지 서브타입으로 구성된다. 그러나 상세한 구조 정보의 부족은 S1PR을 겨냥한 약물 발견을 방해합니다. 여기서는 S1P-S1PRs 복합체의 구조를 해결하기 위해 한전자현미경 방법을 적용하고, 세포 기반 기능성 분석법을 이용하여 활성화, 선택적 약물 인식 및 G-단백질 결합의 메카니즘을 해명하였다. 다른 lysophospholipid receptors (LPLRs) 및 GPCRs도 이 전략을 사용하여 연구될 수 있다.

Introduction

세포막에서 스핑고지질의 대사 산물인 스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 림프구 밀매, 혈관 발달, 내피 완전성, 심박수1,2,3을 포함한 다양한 생물학적 활동을 수반하는 유비쿼터스 리소포스파티드 신호전달 분자이다. S1P는 5개의 S1P 수용체 아류형(S1PRs 1-5)을 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 4,5에 대한 독특한 선호도를 나타냅니다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이는 후속적으로 cAMP 생산을 억제합니다. S1PR2 및 S1PR3은 Gi, Gq 및 G12/13과 결합되고, S1PR4 및 S1PR5는 Gi 및 G12/136을 통해 신호를 트랜스듀스한다.

S1P-S1PR 신호전달은 자가면역 장애7, 염증8, 암 9, 심지어 COVID-19 10 포함한 다수의 질환에 대한 중요한 치료 표적이다. 2010년, 핀골리모드(FTY720)는 재발성 다발성 경화증(MS)11을 치료하기 위해 S1PR을 표적으로 하는 동급 최초의 약물로 허가되었습니다. 그러나, S1PR2를 제외한 모든 S1PR에 결합할 수 있는 반면, S1PR3에 대한 비특이적 결합은 대뇌 피질의 부종, 혈관 및 기관지 수축, 폐 상피 누출(12)을 초래한다. 치료 선택성을 증가시키기 위한 대안적인 전략으로서, 수용체에 대한 아류형 특이적 리간드가 생성되었다. 시포니모드 (BAF312)는 재발 MS 치료13에 대해 2019 년에 승인되었다; S1PR1 및 S1PR5를 효과적으로 타겟팅하는 반면, S1PR3에 대한 친화력은 없으므로 임상 실습14에서 부작용이 적습니다. 2020 년 미국 식품의 약국 (Food and Drug Administration)은 MS 요법15에 대한 ozanimod를 승인했습니다. ozanimod는 S1PR516보다 S1PR1에 대해 25 배 더 큰 선택성을 보유하고있다고보고되었습니다. 특히, 현재의 COVID-19 전염병의 맥락에서, S1PR을 표적으로 하는 작용제 약물이 면역조절 요법 기술(17)을 사용하여 COVID-19를 치료하는데 이용될 수 있다는 것이 발견되었다. 핀골리모드와 비교했을 때, 오자니모드는 COVID-19 환자의 증상을 낮추는 데 우월성을 보였으며, 현재 임상시험10을 진행 중이다. S1PR의 구조적 기초와 기능을 이해하는 것은 S1PRs(18)를 선택적으로 표적으로 하는 약물을 개발하기 위한 중요한 토대를 마련한다.

X선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 및 전자 현미경(EM)을 포함한 생체 거대분자의 구조 정보를 조사하기 위해 많은 기술이 사용됩니다. 2022년 3월 현재, 단백질 데이터뱅크(PDB)에 180,000개 이상의 구조물이 기탁되어 있으며, 대부분은 X선 결정학에 의해 해결되었다. 그러나 2013 년 Yifan Cheng과 David Julius가 201319 년에보고 한 TPRV1 (3.4 Å 해상도)의 첫 번째 근원자 분해능 구조로 인해 냉동 전자 현미경 (cryo-EM)은 단백질 구조의 주류 기술이되었으며 EM PDB 구조의 총 수는 10,000 개가 넘었습니다. 중요한 획기적인 분야는 직접 전자 감지 카메라 및 새로운 이미지 처리 알고리즘으로 알려진 이미징을위한 새로운 카메라 개발입니다. Cryo-EM은 지난20 년 동안 구조 생물학 및 구조 기반 약물 발견에 혁명을 일으켰습니다. 거대 분자 복합체가 살아있는 세포에서 복잡한 역할을 수행하는 방법을 이해하는 것이 생물 과학의 중심 주제이기 때문에 cryo-EM은 특히 막횡단 단백질21에 대한 동적 분자 복합체의 형태를 밝힐 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. G-단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 막횡단 단백질의 가장 큰 수퍼 패밀리이며 현재 시판되는 의약품22의 30 % 이상을 대상으로합니다. cryo-EM의 개발은 GPCR-G 단백질 복합체의 고해상도 구조의 파열에 기여하여 약물 설계23에서 X 선 결정 학적 분석에 여전히 접근 할 수없는 ‘난치성’표적에 대한 구조적 결정을 가능하게했습니다. 따라서, cryo-EM 애플리케이션은 원자 분해능(24)에 가까운 거의 네이티브 조건에서 GPCR의 입체 구조를 결정할 기회를 제공한다. cryo-EM의 발전은 GPCR 자극 또는 억제의 기계론적 토대를 시각화하는 것을 가능하게 하고, GPCR 표적 약물 생성(25)을 위한 신규한 결합 부위를 밝히는데 더 많은 이익을 가져온다.

cryo-EM 기술의 엄청난 진보에 의지하여, 우리는 최근26,27 개의 고뇌하는 S1PR1-, S1PR3- 및 S1PR5-Gi 신호 복합체의 구조를 확인했습니다. 인간에서, S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 4,5에 대한 독특한 선호도를 나타낸다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이후 3′,5′-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 생산을 억제합니다. S1PR3 및 S1PR5는 Gi 6,28과도 결합할 수 있습니다. Gi 결합 수용체 활성화가 cAMP 29의 생산을 감소시키기 때문에, 기능적 변화를 포착하기 위한 cAMP 억제 효과를 측정하기 위해 Gi-억제 cAMP 분석법이 도입되었다26,27. cAMP 결합 단백질 모이어티가 삽입된 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 돌연변이 버전을 사용하여, 이 cAMP 분석은 세포내 cAMP 농도30의 변화를 통해 GPCR 활성을 모니터링하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 이는 민감하고 비방사성 기능성 분석법이며, 약물 발견 목적을 위해 광범위한 GPCRs의 실시간 다운스트림 신호전달을 모니터링하는데 적용될 수 있다(31).

여기서, S1PRs의 활성화 및 약물 인식 모드를 해결하는데 있어서 중요한 방법들에 대한 요약이 제공되며, 주로 cryo-EM 조작 및 Gi-억제 cAMP 분석을 포함한다. 이 기사는 GPCR의 구조와 기능에 대한 추가 탐구를위한 포괄적 인 실험 지침을 제공하는 것을 목표로합니다.

Protocol

1. S1PRs-G 단백질 복합체의 정제 인간 S1PRs-G 단백질 복합체를 정제하기 위해, C 말단 잔기 338-382가 결여된 S1PR1의 cDNA를 복제하고, 야생형 S1PR3, C-말단에서 345-398로 잘린 S1PR5, 야생형 Gi1을 pFastBac1 벡터 및 야생형 Gβ1 및 Gγ2의 cDNA를 pFastBacdual 벡터로 복제한다(표 of Materials).참고: S1PR에 대한 모든 구축물은 또한 해마글루티닌(HA) 신호 서열 다음에 N-말단에 플래그 에피?…

Representative Results

S1PRs-Gi 복합체의 샘플을 동결시키기 전에, 정제된 샘플은 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리되고 겔 여과 크로마토그래피로 분석될 필요가 있다. 도 2 는 S1PR3-Gi 복합체를 예로 들어 나타낸 것이다. 균질한 GPCR-G 단백질 복합체의 피크 분획은 보통 크기-배제 크로마토그래피의 ∼10.5 mL에 위치하였다(도 2A). S1PR3-Gi 복합체의 SDS-page 분석(<strong class="…

Discussion

이 프로토콜은 cryo-EM에 의한 S1PR의 구조를 결정하고 Gi 매개 cAMP 억제 분석법에 의해 S1PR의 활성화 효능을 측정하기 위한 1차 파이프라인을 기술한다. 일부 단계는 실험의 성공에 매우 중요합니다.

S1PRs-Gi 복합체를 정제하려면 바이러스의 품질과 sf9 세포의 건강에 더 많은주의를 기울여야합니다. 수용체의 발현은 불량한 sf9 세포에서 극적으로 감소된다. sf9 ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S1PRs-Gi 복합체의 데이터는 쓰촨 대학의 서중국 Cryo-EM 센터와 남부 과학 기술 대학 (SUSTech)의 Cryo-EM 센터에서 수확되었으며 쓰촨 대학의 Duyu 고성능 컴퓨팅 센터에서 처리되었습니다. 이 연구는 중국 자연 과학 재단 (32100965 L.C., W.Y.에서 32100988, 31972916에서 Z.S.까지)과 쓰촨 대학의 전임 박사후 연구 기금 (2021SCU12003에서 L.C.까지)의 지원을 받았습니다.

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

Referanslar

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O’Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3′,5′-monophosphate and guanosine cyclic 3′,5′-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

View Video