Özet

Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

Published: June 08, 2022
doi:

Özet

S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de la subfamilia de receptores S1P (S1PRs). Aquí, se describe una tubería para exponer las estructuras y la función de los S1PR.

Abstract

Los lisofosfolípidos (LPL) son lípidos bioactivos que incluyen esfingosina 1-fosfato (S1P), ácido lisofosfatídico, etc. S1P, un producto metabólico de los esfingolípidos en la membrana celular, es uno de los LPL mejor caracterizados que regula una variedad de respuestas fisiológicas celulares a través de vías de señalización mediadas por receptores de esfingosina 1-fosfato (S1PR). Esto implicó que el sistema de señalización S1P-S1PR es un objetivo terapéutico potencial notable para trastornos, incluida la esclerosis múltiple (EM), trastornos autoinmunes, cáncer, inflamación e incluso COVID-19. Los S1PR, un pequeño subconjunto de la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de clase A, se componen de cinco subtipos: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 y S1PR5. Sin embargo, la falta de información estructural detallada impide el descubrimiento de fármacos dirigidos a los S1PR. Aquí, aplicamos el método de microscopía crioelectrónica para resolver la estructura del complejo S1P-S1PRs, y dilucidamos el mecanismo de activación, el reconocimiento selectivo de fármacos y el acoplamiento de proteínas G mediante el uso de ensayos funcionales basados en células. Otros receptores de lisofosfolípidos (LPLR) y GPCR también se pueden estudiar utilizando esta estrategia.

Introduction

La esfingosina-1-fosfato (S1P), un producto metabólico de los esfingolípidos en la membrana celular, es una molécula de señalización lisofosfatídica ubicua que involucra diversas actividades biológicas, incluyendo el tráfico de linfocitos, el desarrollo vascular, la integridad endotelial y la frecuencia cardíaca 1,2,3. S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de cinco subtipos de receptores S1P (S1PRs 1-5); Los S1PR se encuentran en una variedad de tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo 4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de cAMP; S1PR2 y S1PR3 están acoplados con Gi, Gq y G12/13, y S1PR4 y S1PR5 transducen la señal a través de Gi y G12/136.

La señalización S1P-S1PR es un objetivo terapéutico crítico para múltiples enfermedades, incluidos los trastornos autoinmunes7, la inflamación8, el cáncer9 e incluso COVID-1910. En 2010, el fingolimod (FTY720) fue autorizado como un fármaco de primera clase dirigido a S1PR para tratar la esclerosis múltiple (EM) de recaída11. Sin embargo, es capaz de unirse a todos los S1PR excepto a S1PR2, mientras que la unión no específica a S1PR3 produce edema de la corteza cerebral, constricción vascular y bronquial, y fuga epitelial pulmonar12. Como estrategia alternativa para aumentar la selectividad terapéutica, se han producido ligandos específicos de subtipo para el receptor. Siponimod (BAF312) fue aprobado en 2019 para el tratamiento de la EM en recaída13; se dirige eficazmente a S1PR1 y S1PR5, mientras que no tiene afinidad por S1PR3, exhibiendo menos efectos secundarios en la práctica clínica14. En 2020, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos autorizó ozanimod para la terapia de EM15. Se ha informado que ozanimod tiene una selectividad 25 veces mayor para S1PR1 que para S1PR516. En particular, en el contexto de la actual pandemia de COVID-19, se ha descubierto que los fármacos agonistas dirigidos a S1PR pueden utilizarse para tratar COVID-19 mediante el uso de técnicas de terapia inmunomoduladora17. En comparación con el fingolimod, el ozanimod ha demostrado superioridad en la reducción de los síntomas en pacientes con COVID-19 y ahora está siendo sometido a ensayos clínicos10. Comprender la base estructural y la función de los S1PR establece una base significativa para desarrollar un fármaco que se dirija selectivamente a los S1PR18.

Se utilizan muchas técnicas para investigar la información estructural de las biomacromoléculas, incluida la cristalografía de rayos X, la resonancia magnética nuclear (RMN) y la microscopía electrónica (EM). A marzo de 2022, hay más de 180.000 estructuras depositadas en el Protein Databank (PDB), y la mayoría de ellas se han resuelto mediante cristalografía de rayos X. Sin embargo, con la primera estructura de resolución casi atómica de TPRV1 (resolución 3.4 Å) reportada por Yifan Cheng y David Julius en 201319, la microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha convertido en una técnica convencional para estructuras de proteínas, y el número total de estructuras EM PDB fue de más de 10,000. Las áreas críticas de avance son el desarrollo de nuevas cámaras para imágenes conocidas como cámaras de detección directa de electrones y nuevos algoritmos de procesamiento de imágenes. Cryo-EM ha revolucionado la biología de la estructura y el descubrimiento de fármacos basados en la estructura en la última década20. Como la comprensión de cómo los complejos macromoleculares cumplen sus complicadas funciones en la célula viva es un tema central en las ciencias biológicas, la crio-EM tiene el potencial de revelar conformaciones de complejos moleculares dinámicos, particularmente para proteínas transmembrana21. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la superfamilia más grande de proteínas transmembrana y los objetivos de más del 30% de los productos farmacéuticos comercializados actualmente22. El desarrollo de crio-EM ha contribuido a una explosión de estructuras de alta resolución de complejos de proteínas GPCR-G, permitiendo la determinación estructural de objetivos “intratables” que aún no son accesibles para el análisis cristalográfico de rayos X en el diseño de fármacos23. Por lo tanto, la aplicación crio-EM proporciona la oportunidad de determinar la estructura tridimensional de los GPCR en condiciones casi nativas cercanas a la resolución atómica24. Los avances en crio-EM permiten visualizar los fundamentos mecanicistas de la estimulación o inhibición de GPCR, y un beneficio adicional en el descubrimiento de los nuevos sitios de unión para la creación de fármacos dirigidos a GPCR25.

Confiando en los tremendos avances de la tecnología crio-EM, hemos identificado estructuras de complejos de señalización S1PR1-, S1PR3- y S1PR5-Gi agonizantes recientemente26,27. En humanos, los S1PR se encuentran en varios tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo 4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 3′,5′. S1PR3 y S1PR5 también son capaces de acoplarse con Gi 6,28. Dado que la activación del receptor acoplado a Gi disminuye la producción de cAMP29, se introdujo un ensayo de inhibición de Gi-amp para medir los efectos de inhibición de cAMP para capturar alteraciones funcionales26,27. Utilizando una versión mutante de Photinus pyralis luciferase en la que se ha insertado una fracción de proteína de unión a cAMP, este ensayo de cAMP ofrece un método simple y confiable para monitorear la actividad de GPCR a través de cambios en la concentración intracelular de cAMP30. Es un ensayo funcional sensible y no radiactivo y puede aplicarse para monitorear la señalización descendente en tiempo real de una amplia gama de GPCR con fines de descubrimiento de fármacos31.

Aquí, se proporciona un resumen de los métodos críticos para resolver los modos de activación y reconocimiento de fármacos de S1PR, que incluyen principalmente manipulaciones crio-EM y un ensayo de cAMP de inhibición Gi. Este artículo tiene como objetivo proporcionar una guía experimental completa para futuras exploraciones en las estructuras y funciones de los GPCR.

Protocol

1. Purificación del complejo proteico S1PRs-G Para purificar el complejo proteico humano S1PRs-G, clonar los ADNc de S1PR1 que carecen de residuos C-terminales 338-382, el tipo salvaje S1PR3, S1PR5 truncado con 345-398 en C-terminal, y el tipo salvaje Gi1 en el vector pFastBac1 y los ADNc del tipo salvaje Gβ1 y Gγ2 en el vector pFastBacdual (Tabla de materiales).NOTA: Todas las construcciones para S1PR también contienen la secuencia de señal de hemaglutinina (HA) segui…

Representative Results

Antes de congelar la muestra del complejo S1PRs-Gi, la muestra purificada debe separarse mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y analizarse con cromatografía de filtración en gel. La figura 2 muestra el complejo S1PR3-Gi como ejemplo. La fracción pico del complejo homogéneo de proteínas GPCR-G generalmente se localizó en ~ 10.5 ml de la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2A). El análisis de la página SDS del complejo S1PR3-G…

Discussion

Este protocolo describe una tubería primaria para determinar las estructuras de S1PR mediante crio-EM y medir la potencia de activación de S1PR mediante un ensayo de inhibición de cAMP mediado por Gi. Algunos pasos son cruciales para el éxito del experimento.

Para purificar el complejo S1PRs-Gi, se debe prestar más atención a la calidad del virus y a la salud de las células sf9 . La expresión del receptor se reduce drásticamente en las células sf9 pobres. La salud d…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los datos del complejo S1PRs-Gi se recolectaron en el Centro Cryo-EM de China Occidental en la Universidad de Sichuan y el Centro Cryo-EM en la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur (SUSTech) y se procesaron en el Centro de Computación de Alto Rendimiento Duyu en la Universidad de Sichuan. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (32100965 a L.C., 32100988 a W.Y., 31972916 a Z.S.) y el Fondo de Investigación Postdoctoral a tiempo completo de la Universidad de Sichuan (2021SCU12003 a L.C.)

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
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catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
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gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
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