Özet

Um pipeline para investigar as estruturas e caminhos de sinalização de receptores sphingosine 1-fosfato

Published: June 08, 2022
doi:

Özet

O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através da subfamília de receptores S1P (S1PRs). Aqui, um pipeline é descrito para expor sobre as estruturas e função das S1PRs.

Abstract

Lisofosfolipídios (LPLs) são lipídios bioativos que incluem sphingosine 1-fosfato (S1P), ácido linfosfídico, etc. O S1P, um produto metabólico de sphingolipids na membrana celular, é um dos LPLs mais bem caracterizados que regula uma variedade de respostas fisiológicas celulares através de vias de sinalização mediadas por receptores de sphingosina 1-fosfato (S1PRs). Isso implicava que o sistema de sinalização S1P-S1PRs é um alvo terapêutico potencial notável para distúrbios, incluindo esclerose múltipla (EM), doenças autoimunes, câncer, inflamação e até COVID-19. Os S1PRs, um pequeno subconjunto da família de receptores acoplado de proteínaS A (GPCR), são compostos por cinco subtipos: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 e S1PR5. A falta de informações estruturais detalhadas, no entanto, impede a descoberta de drogas visando S1PRs. Aqui, aplicamos o método de microscopia crio-elétron para resolver a estrutura do complexo S1P-S1PRs, e elucidamos o mecanismo de ativação, reconhecimento seletivo de drogas e acoplamento de proteína G usando ensaios funcionais baseados em células. Outros receptores linfosfolipídos (LPLRs) e GPCRs também podem ser estudados usando essa estratégia.

Introduction

Sphingosine-1-fosfato (S1P), um produto metabólico de sphingolipids na membrana celular, é uma molécula de sinalização linfosfídica onipresente que envolve várias atividades biológicas, incluindo tráfico de linfócitos, desenvolvimento vascular, integridade endotelial e frequência cardíaca 1,2,3. O S1P exerce seus diversos efeitos fisiológicos através de cinco subtipos receptores S1P (S1PRs 1-5); Os S1PRs são encontrados em uma variedade de tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante 4,5. O S1PR1 é principalmente acoplado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de cAMP; S1PR2 e S1PR3 são acoplados com Gi, Gq e G12/13, e S1PR4 e S1PR5 transdutos através de Gi e G12/136.

A sinalização S1P-S1PR é um alvo terapêutico crítico para múltiplas doenças, incluindo doenças autoimunes7, inflamação8, câncer9 e até COVID-1910. Em 2010, o fingolimod (FTY720) foi licenciado como um medicamento de primeira classe direcionado aos S1PRs para tratar a esclerose múltipla da recaída (MS)11. No entanto, é capaz de vincular a todos os S1PRs, exceto S1PR2, enquanto a ligação inespecífica ao S1PR3 resulta em edema do córtex cerebral, constrição vascular e brônquica e vazamento epitelialpulmonar 12. Como estratégia alternativa para aumentar a seletividade terapêutica, foram produzidos ligantes específicos do subtipo para o receptor. O Siponimod (BAF312) foi aprovado em 2019 para o tratamento de recaída de MS13; ele visa efetivamente S1PR1 e S1PR5, enquanto não tem afinidade com OPR3, apresentando menos efeitos colaterais na prática clínica14. Em 2020, a Food and Drug Administration dos EUA autorizou o ozanimod para a terapia deESM 15. Foi relatado que o ozanimod possui uma seletividade 25 vezes maior para S1PR1 do que para S1PR516. Notavelmente, no contexto da atual pandemia COVID-19, descobriu-se que drogas agonistas direcionadas às S1PRs podem ser utilizadas para tratar o COVID-19 usando técnicas de terapia imunomodulatória17. Em comparação com fingolimod, o ozanimod tem mostrado superioridade na redução dos sintomas em pacientes COVID-19 e agora está sendo submetido a testes clínicos10. Compreender a base estrutural e a função dos S1PRs estabelece uma base significativa para o desenvolvimento de uma droga que tem como alvo seletivamente as S1PRs18.

Muitas técnicas são usadas para investigar as informações estruturais de biomacromléculas, incluindo cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia eletrônica (EM). A partir de março de 2022, existem mais de 180.000 estruturas depositadas no Protein Databank (PDB), e a maioria delas foi resolvida pela cristalografia de raios-X. No entanto, com a primeira estrutura de resolução quase atômica da TPRV1 (resolução 3.4 Å) relatada por Yifan Cheng e David Julius em 201319, a microscopia crio-elétron (crio-EM) tornou-se uma técnica mainstream para estruturas proteicas, e o número total de estruturas em PDB foi superior a 10.000. As áreas de avanço crítica são o desenvolvimento de novas câmeras para imagens conhecidas como câmeras diretas de detecção de elétrons e novos algoritmos de processamento de imagens. A Crio-EM revolucionou a biologia da estrutura e a descoberta de drogas baseada em estruturas na última década20. Como entender como os complexos macromoleculares cumprem seus complicados papéis na célula viva é um tema central nas ciências biológicas, o crio-EM tem o potencial de revelar conformações de complexos moleculares dinâmicos, particularmente para proteínas transmembranas21. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior superfamília de proteínas transmembranas e as metas de mais de 30% dos fármacos atualmente comercializados22. O desenvolvimento da crio-EM contribuiu para uma explosão de estruturas de alta resolução de complexos proteicos GPCR-G, permitindo a determinação estrutural para alvos “intratáveis” que ainda não estão acessíveis à análise cristalográfica de raios-X no designde medicamentos 23. Assim, o aplicativo crio-EM oferece a chance de determinar a estrutura tridimensional dos GPCRs em condições quase nativas perto da resolução atômica24. Os avanços no crio-EM tornam possível visualizar fundamentos mecanicistas da estimulação ou inibição do GPCR, e se beneficiar ainda mais na descoberta dos novos locais de vinculação para a criação de medicamentos direcionados ao GPCR25.

Contando com os tremendos avanços da tecnologia crio-EM, identificamos estruturas de complexos de sinalização Agonizantes S1PR1-, S1PR3 e S1PR5-Gi recentemente26,27. Em humanos, os S1PRs são encontrados em vários tecidos e exibem preferências únicas para proteínas G a jusante 4,5. O S1PR1 é principalmente associado à proteína Gi, que posteriormente inibe a produção de monofosfato de adenosina 3′,5′cíclica (cAMP). S1PR3 e S1PR5 também são capazes de acoplamento com Gi 6,28. Uma vez que a ativação do receptor acoplado gi diminui a produção de cAMP29, um ensaio de cAMP de inibição gi foi introduzido para medir os efeitos de inibição de cAMP para capturar alterações funcionais 26,27. Usando uma versão mutante de Photinus pyralis luciferase em que uma umidade de proteína de ligação cAMP foi inserida, este ensaio cAMP oferece um método simples e confiável para monitorar a atividade gpcr através de alterações na concentração cAMP intracelular30. É um ensaio funcional sensível e não radioativo e pode ser aplicado para monitorar a sinalização a jusante em tempo real de uma ampla gama de GPCRs para fins de descoberta de drogas31.

Aqui, é fornecido um resumo dos métodos críticos na resolução dos modos de ativação e reconhecimento de drogas dos S1PRs, incluindo principalmente manipulações crio-EM e um ensaio cAMP de inibição gi. Este artigo tem como objetivo fornecer orientação experimental abrangente para novas explorações nas estruturas e funções dos GPCRs.

Protocol

1. Purificação do complexo proteico S1PRs-G Para purificar o complexo proteico S1PRs-G humano, clonem os cDNAs de S1PR1 sem resíduos terminais C 338-382, o tipo selvagem S1PR3, S1PR5 truncado com 345-398 em C-terminus, e o tipo selvagem Gi1 no vetor pFastBac1 e os cDNAs do tipo selvagem Gβ1 e Gγ2 no vetor pFastBacdual (Tabela de Materiais).NOTA: Todas as construções para S1PRs também contêm a sequência de sinal haemagglutinin (HA), seguida por uma tag de epítope …

Representative Results

Antes de congelar a amostra do complexo S1PRs-Gi, a amostra purificada precisa ser separada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e analisada com cromatografia de filtração de gel. A Figura 2 mostra o complexo S1PR3-Gi como exemplo. A fração máxima do complexo proteico GPCR-G homogêneo foi geralmente localizada a ~10,5 mL da cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 2A). A análise de página SDS do complexo S1PR3-Gi (Fig…

Discussion

Este protocolo descreve um pipeline primário para determinar as estruturas de S1PRs por crio-EM e medir a potência de ativação dos S1PRs pelo ensaio de inibição cAMP mediado por Gi. Alguns passos são cruciais para o sucesso do experimento.

Para purificar o complexo S1PRs-Gi, a qualidade do vírus e a saúde das células SF9 devem ser mais atentas. A expressão do receptor é drasticamente reduzida em células pobres de Sf9 . A saúde das células SF9 foi avali…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os dados do complexo S1PRs-Gi foram colhidos no Centro Crio-EM da China Ocidental na Universidade de Sichuan e no Cryo-EM Center na Universidade do Sul de Ciência e Tecnologia (SUSTech) e processados no Centro de Computação de Alto Desempenho duyu na Universidade de Sichuan. Este trabalho foi apoiado pela Natural Science Foundation of China (32100965 para L.C., 32100988 a W.Y., 31972916 à Z.S.) e pelo Fundo de Pesquisa pós-doutorado em tempo integral da Universidade de Sichuan (2021SCU12003 a L.C.)

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
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agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

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