Эта процедура описывает, как быстро инициировать, расширять и связывать нейриты, организованные в микрожидкостных камерах, с использованием покрытых поли-D-лизином гранул, закрепленных на микропипетках, которые направляют удлинение нейритов.
Мозг и повреждение спинного мозга могут привести к постоянной нетрудоспособности и смерти, поскольку еще невозможно восстановить нейроны на большие расстояния и точно восстановить их с подходящей целью. Здесь описывается процедура быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Достигнутые скорости распространения достигают более 1,2 мм / ч, в 30-60 раз быстрее, чем скорости in vivo наиболее быстро растущих аксонов из периферической нервной системы (0,02-0,04 мм / ч) 28 и в 10 раз быстрее, чем сообщалось ранее для того же Нейронного типа на ранней стадии развития 4 . Во-первых, выделенные популяции нейронов гиппокампа крысы выращиваются в течение 2-3 недель в микрожидкостных устройствах для точного позиционирования клеток, что позволяет легко микроманипулировать и экспериментальную воспроизводимость. Затем бисер, покрытый поли-D-лизином (PDL), помещают на нейриты для образования адгезивного продолженияАкты и микроманипуляция пипеткой используются для перемещения полученного в результате комплекса шариков-нейритов. Когда шарик перемещается, он вытягивает новый нейрит, который может быть увеличен на сотни микрометров и функционально связан с клеткой-мишенью менее чем за 1 час. Этот процесс позволяет экспериментальную воспроизводимость и легкость манипулирования, минуя более медленные химические стратегии для индуцирования роста нейритов. Предварительные измерения, представленные здесь, демонстрируют темпы роста нейронов, значительно превышающие физиологические. Объединение этих нововведений позволяет точно установить нейронные сети в культуре с беспрецедентной степенью контроля. Это новый метод, который открывает дверь для множества информации и информации о передаче сигналов и коммуникации в нейронной сети, а также является игровой площадкой, в которой можно исследовать пределы роста нейронов. Потенциальные применения и эксперименты широко распространены с прямыми последствиями для терапии, целью которой является воссоединение нейроныЛ после травмы или при нейродегенеративных заболеваниях.
Повреждения центральной центральной нервной системы (ЦНС) взрослых могут привести к постоянной нетрудоспособности из-за множественных механизмов, которые ограничивают рост аксонов 1 . После травмы многие аксоны ЦНС не образуют новый конус роста и не могут установить эффективный регенеративный ответ 2 . Кроме того, повреждение и рубцовая ткань, окружающие поражения ЦНС, значительно ингибируют рост аксонов 1 , 2 , 3 . Современные методы лечения регенерации ЦНС после травмы были сосредоточены на усилении собственного потенциала роста поврежденного нейрона и на маскировке ингибиторов аксонального расширения, связанных с мусором миелина и глиальным рубцом 1 , 3 . Несмотря на это, способность регенерировать длинные аксоны к отдаленным объектам и формировать соответствующие функциональные синапсы по-прежнему сильно ограничена 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
В настоящей работе микробазы, микроманипуляция пипеткой и микрожидкостные устройства используются для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Предыдущие работы показали, что гранулы с поли-D-лизином (PDL-шарики) индуцируют мембранную адгезию, за которыми следует кластеризация комплексов синаптических везикул и образование функциональных пресинаптических бутонов 8 . Было также показано, что когда PDL-шарик механически оттягивается после пресинаптической дифференциации, синаптический белковый кластер следует за бортом, инициируя новый нейрит 9 . Следующая процедура использует этот факт наряду с возможностью культивирования эмбриональных нейронов гиппокампа крыс в организованные области на покровное стекло с использованием микрожидкостных устройств с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) для точной перемотки нейронацепи.
Эти микрофлюидные устройства PDMS нетоксичны, оптически прозрачны и состоят из двух камер, соединенных системой микроканалов. После сборки на покровное стекло каждое устройство служит в качестве формы для направления роста нейронов и поддержания здоровых нейронных культур на точных рисунках более 4 недель in vitro .
Здесь представлена структура, в которой исследуются пределы расширения и функциональности нового нейрита. Новые, функциональные нейриты создаются и позиционируются для управления (re) проволочными нейронными сетями. Достигнутые скорости расширения превышают 20 мкм / мин на расстояниях в миллиметрах и устанавливаются функциональные соединения. Эти результаты неожиданно показывают, что внутренняя способность этих нейритов к удлинению намного быстрее, чем считалось ранее. Этот предлагаемый механический подход обходит медленные химические стратегии и обеспечивает контролируемое соединение с конкретной мишенью. ThЭто технология открывает новые возможности для исследования in vitro новых методов лечения для восстановления связи нейронов после травмы. Он также позволяет манипулировать и перестраивать нейронные сети для исследования фундаментальных аспектов обработки сигналов нейронов и нейронной функции in vitro .
Используя стандартную микроманипуляцию и инновационные микрожидкостные устройства, был разработан новый метод для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на больших расстояниях. Микроманипуляция пипеткой является обычным инстр?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Yoichi Miyahara за многие полезные обсуждения и идеи. MA и PG признают финансирование со стороны НСУРК.
Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |