Questa procedura descrive come avviare rapidamente, estendere e collegare neuriti organizzati in camere microfluidiche utilizzando perline poli-D-lisina fissate a micropipette che guidano l'allungamento del neurite.
La lesione del cervello e del midollo spinale può portare a disabilità permanente e alla morte perché non è ancora possibile rigenerare i neuroni per lunghe distanze e ricollegarle con un bersaglio adeguato. Qui viene descritta una procedura per iniziare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. I tassi di estensione raggiunti raggiungono oltre 1,2 mm / h, 30-60 volte più velocemente rispetto ai tassi in vivo degli assoni in crescita più veloci del sistema nervoso periferico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 volte più veloci di quanto riportato in precedenza per gli stessi Tipo neuronale in una fase precedente dello sviluppo 4 . In primo luogo, le popolazioni isolate di neuroni ippocampali del ratto vengono coltivate per 2-3 settimane in dispositivi microfluidici per posizionare le cellule in modo preciso, consentendo una facile micromanipolazione e una riproducibilità sperimentale. Successivamente, le perle ricoperte di poli-D-lisina (PDL) vengono poste sulle neurite per formare cont. AdesiveGli atti e la micromanipolazione pipettata vengono utilizzati per spostare il complesso bead-neurite risultante. Mentre il tallone viene spostato, estrae un nuovo neurite che può essere esteso su centinaia di micrometri e collegato funzionalmente a una cellula bersaglio in meno di 1 h. Questo processo consente la riproducibilità sperimentale e la facilità di manipolazione, escludendo strategie chimiche più lente per indurre la crescita del neurite. Le misure preliminari presentate qui dimostrano un tasso di crescita neuronale molto superiore a quelle fisiologiche. Combinando queste innovazioni permette la precisa creazione di reti neuronali nella cultura con un grado di controllo senza precedenti. È un metodo nuovo che apre la porta ad una pletora di informazioni e approfondimenti sulla trasmissione del segnale e sulla comunicazione all'interno della rete neuronale, nonché come un parco giochi in cui esplorare i limiti della crescita neuronale. Le potenziali applicazioni e gli esperimenti sono diffusi con implicazioni dirette per terapie che mirano a ricollegare la neuronaL circuiti dopo trauma o in malattie neurodegenerative.
Le lesioni al sistema nervoso centrale adulto (CNS) possono portare a disabilità permanente a causa di meccanismi multipli che limitano la ricrescita assonale 1 . Dopo l'infortunio, molti assoni CNS non formano un nuovo cono di crescita e non riescono a montare una risposta efficace rigenerativa 2 . Inoltre, i danni e il tessuto delle cicatrici che circondano lesioni del CNS inibiscono significativamente la crescita axonica 1 , 2 , 3 . Le terapie correnti per promuovere la rigenerazione del SNC dopo lesioni sono state focalizzate sul miglioramento del potenziale di crescita intrinseco del neurone danneggiato e sulla mascheratura degli inibitori dell'estensione assonica associata a detriti di mielina e la cicatrice gliale 1 , 3 . Nonostante ciò la capacità di rigenerare gli assi lunghi a obiettivi lontani e di formare appropriate sinapsi funzionali rimane gravemente limitata 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
Nell'attuale lavoro, microbeads, micromanipolazione pipettata e dispositivi microfluidici vengono utilizzati per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. Precedenti lavori hanno dimostrato che le perline ricoperte da poli-D-lisina inducono l'adesione della membrana seguita dal clustering dei complessi di vescicole sinaptici e la formazione di bouton presinaptici funzionali 8 . È stato inoltre dimostrato che quando il PDL-bead viene tirato meccanicamente dopo la differenziazione presinaptica, il cluster proteico sinaptico segue il branco, innescando un nuovo neurite 9 . La seguente procedura sfrutta questo fatto insieme alla capacità di coltivare i neuroni ippocampali embrionali di ratti in regioni organizzate su una copertura con dispositivi microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) per ricreare con precisione un neuronecircuito.
Questi dispositivi microfluidici PDMS sono non tossici, otticamente trasparenti e sono costituiti da due camere collegate da un sistema di microchannel. Una volta assemblati su una copertura, ogni apparecchio serve come uno stampo per guidare la crescita neuronale e mantenere sani le culture neuronali su modelli precisi per più di 4 settimane in vitro .
Qui viene presentato un quadro per studiare i limiti di estensione e funzionalità del nuovo neurite. Nuove funzionalità neurite vengono create e posizionate per controllare (re) le reti neuronali. I tassi di estensione raggiunti sono più veloci di 20 μm / min su distanze di millimetro e sono stabilite le connessioni funzionali. Questi risultati mostrano inaspettatamente che la capacità intrinseca di queste neuriti per allungamento è molto più veloce di quanto precedentemente pensato. Questo approccio meccanico proposto supera strategie chimiche lente e consente la connessione controllata ad un target specifico. thÈ la tecnica apre nuove vie per lo studio in vitro di nuove terapie per ripristinare la connettività neuronale dopo il danno. Permette inoltre la manipolazione e il riavvolgimento delle reti neuronali per indagare aspetti fondamentali dell'elaborazione dei segnali neuronali e della funzione neuronale in vitro .
Grazie alla micromanipolazione standard e ai dispositivi innovativi microfluidici, è stata sviluppata una nuova tecnica per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a grandi distanze. La micromanipolazione della pipetta è uno strumento comune nella maggior parte dei laboratori neuroscienze 4 , 13 . La vera sfida per ottenere risultati riproducibili e affidabili è stata la standardizzazione di culture neuronali sane e posi…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Yoichi Miyahara per molte discussioni e approfondimenti utili. MA e PG riconoscono il finanziamento da NSERC.
Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |