この手順は、神経突起の伸長を誘導するマイクロピペットに固定されたポリ-D-リシン被覆ビーズを使用して、マイクロ流体チャンバーに組織化された神経突起を迅速に開始、伸長および連結する方法を記載する。
脳および脊髄損傷は、長距離にわたってニューロンを再生し、それらを適切な標的に正確に再接続することが依然として不可能であるため、永久的な障害および死につながる可能性がある。ここでは、新しい機能的なニューロン回路を長距離にわたって迅速に開始、伸長、および正確に接続する手順が記載されている。達成された伸長速度は、末梢神経系からの最も速く成長する軸索のインビボ速度(0.02〜0.04mm / h)よりも30〜60倍速く1.2mm / hを超え、以前に報告されたものよりも10倍速い開発の初期段階でのニューロン型4 。第1に、ラット海馬ニューロンの単離された集団を、微小流体装置において2〜3週間増殖させ、細胞を正確に配置し、容易なマイクロマニピュレーションおよび実験的再現性を可能にする。次に、ポリ-D-リシン(PDL)で被覆されたビーズを神経突起上に置き、接着性contビーズ – 神経突起複合体を移動させるためにピペットマイクロマニピュレーションを使用する。ビーズを動かすと、数百マイクロメートルを超えて機能し、標的細胞と機能的に1時間未満で結合することができる新しい神経突起が引き出される。このプロセスは、実験的な再現性および操作の容易さを可能にし、より遅い化学的戦略をバイパスして神経突起成長を誘導する。ここで提示された予備測定は、生理学的なものをはるかに超えるニューロンの成長速度を実証する。これらの技術革新を組み合わせることで、これまでにないほどの制御力で、文化におけるニューロンネットワークの正確な確立が可能になります。それはニューロンの成長の限界を探索する遊び場であるだけでなく、ニューロンネットワーク内の信号伝達および伝達についての過度の情報および洞察の扉を開く新規な方法である。潜在的な適用および実験は、ニューロンの再接続を目的とした治療法に直接的な影響が広がっている外傷後または神経変性疾患においてl回路を阻害する。
成人の中枢神経系(CNS)への損傷は、軸索の再増殖を制限する複数の機構のために恒久的な障害を引き起こす可能性があります1 。傷害後、多くのCNS軸索は新たな成長円錐を形成せず、効果的な再生応答2を達成しない 。さらに、CNS病変を取り囲む損傷および瘢痕組織は、軸索成長を有意に阻害する1,2,3 。損傷後のCNS再生を促進するための現在の治療法は、傷害ニューロンの内因性増殖能の増強およびミエリン屑およびグリア瘢痕に関連する軸索伸長の阻害剤をマスキングすることに集中している1,3。それにもかかわらず、遠くの標的に長い軸索を再生し、適切な機能的シナプスを形成する能力は、依然として厳しく制限されている4 、 </sup.5,6,7。
現在の研究では、マイクロビーズ、ピペットマイクロマニピュレーション、およびマイクロ流体デバイスを使用して、長距離にわたって新しい機能的なニューロン回路を迅速に開始、伸長および正確に接続する。以前の研究は、ポリ-D-リシン被覆ビーズ(PDL-ビーズ)が膜接着を誘導し、続いてシナプス小胞複合体のクラスター化および機能的シナプス前隆起の形成を示した8 。シナプス分化後にPDLビーズを機械的に引き離すと、シナプスタンパク質クラスターがビーズに追従し、新しい神経突起9が始まることも示されています。以下の手順は、この事実を、ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体装置を用いてカバースリップ上の組織化された領域にラットの胚海馬ニューロンを培養してニューロンを正確に再配線する能力回路。
これらのPDMSマイクロ流体デバイスは、毒性がなく、光学的に透明であり、マイクロチャネルのシステムによって接続された2つのチャンバからなる。一旦カバースリップ上に組み立てられると、各デバイスは、ニューロンの成長を誘導し、正確なパターンで健康なニューロン培養を維持し、インビトロで 4週間より長く維持するための型として役立つ。
ここでは、新しい神経突起の拡張および機能の限界を調べるための枠組みが提示されている。新しく機能的な神経突起が作製され、ニューロンネットワークを制御可能に(再)配線するように配置される。達成される伸長速度は、ミリメートルスケールの距離にわたって20μm/分より速く、機能的接続が確立される。これらの結果は予想外に、これらの神経突起の伸長に対する固有の能力が以前考えられていたよりもはるかに速いことを示している。この提案された機械的アプローチは、遅い化学戦略をバイパスし、特定の標的への制御された接続を可能にする。 Th技術は、傷害後のニューロンの接続性を回復するための新規療法のインビトロ研究のための新しい道を開く。それはまた、ニューロンネットワークの操作および再配線を可能にして、 インビトロでのニューロンのシグナルプロセッシングおよびニューロン機能の基本的な側面を調べる。
標準的なマイクロマニピュレーションおよび革新的なマイクロ流体デバイスを使用して、新しい機能的なニューロン回路を遠距離に迅速に開始、伸長および正確に接続するための新しい技術が開発された。ピペットマイクロマニュピュレーションは、ほとんどの神経科学ラボ4,13で一般的なツールです。再現性と信頼性の高い結果を達成するための真の課題は、マイクロメーターの精度で細胞…
The authors have nothing to disclose.
多くの有益な議論と洞察をいただき、宮原陽一に感謝したいと思います。 MAとPGはNSERCからの資金調達を認めている。
Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |