يصف هذا الإجراء كيفية البدء بسرعة، وتوسيع وربط نيوريتس نظمت في غرف ميكروفلويديك باستخدام حبات بولي-D- يسين المغلفة ثابتة إلى ميكروبيبيتس أن دليل استطالة النوريت.
إصابات الدماغ والحبل الشوكي قد تؤدي إلى العجز الدائم والموت لأنه لا يزال غير ممكن لتجديد الخلايا العصبية على مسافات طويلة وإعادة توصيلها بدقة مع الهدف المناسب. هنا يتم وصف الإجراء لبدء بسرعة، استطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. معدلات التمدد التي تحققت تصل إلى أكثر من 1.2 ملم / ساعة، 30-60 مرات أسرع من معدلات الجسم الحي من الأسرع محاور الأسرع نموا من الجهاز العصبي المحيطي (0.02 إلى 0.04 ملم / ساعة) 28 و 10 مرات أسرع مما سبق ذكره لنفس نوع الخلايا العصبية في مرحلة مبكرة من التنمية 4 . أولا، تزرع مجموعات معزولة من الخلايا العصبية الحصين الفئران لمدة 2-3 أسابيع في الأجهزة ميكروفلويديك لوضع بدقة الخلايا، مما يتيح سهولة ميكرومانيبولاتيون والتكاثر التجريبية. المقبل، يتم وضع الخرز المغلفة مع بولي- D- يسين (بدل) على نيوريتس لتشكيل لاصق كونتوتستخدم ميكروومانيبولاتيون ماصة لنقل الناتج حبة نيوريت معقدة. كما يتم نقل حبة، فإنه يسحب نيوريت جديدة التي يمكن أن تمتد على مئات من ميكرومتر ومتصل وظيفيا إلى خلية الهدف في أقل من 1 ساعة. هذه العملية تمكن استنساخ التجريبية وسهولة التلاعب في حين تجاوز الاستراتيجيات الكيميائية أبطأ للحث على نمو العصبية. تظهر القياسات الأولية المعروضة هنا معدل نمو الخلايا العصبية تتجاوز بكثير تلك الفسيولوجية. الجمع بين هذه الابتكارات يسمح للإنشاء الدقيق للشبكات العصبية في الثقافة مع درجة غير مسبوقة من السيطرة. بل هو طريقة جديدة تفتح الباب أمام مجموعة كبيرة من المعلومات والأفكار في نقل الإشارات والاتصالات داخل الشبكة العصبية وكذلك كونها ملعبا فيها لاستكشاف حدود نمو الخلايا العصبية. التطبيقات والتجارب المحتملة على نطاق واسع مع آثار مباشرة على العلاجات التي تهدف إلى إعادة ربط نيورونال الدوائر بعد الصدمة أو في الأمراض العصبية التنكسية.
الإصابات في الجهاز العصبي المركزي الكبار (نس) قد يؤدي إلى إعاقة دائمة بسبب آليات متعددة تحد من نمو محور عصبي 1 . بعد الإصابة، العديد من المحاور العصبية الجهاز العصبي المركزي لا تشكل مخروط نمو جديد وتفشل في جبل استجابة التجدد فعالة 2 . وعلاوة على ذلك، والضرر والأنسجة ندبة المحيطة الآفات الجهاز العصبي المركزي تمنع بشكل كبير نمو محور عصبي 1 ، 2 ، 3 . وقد ركزت العلاجات الحالية لتعزيز الجهاز العصبي المركزي تجديد بعد الإصابة على تعزيز إمكانات النمو الجوهري للخلايا العصبية المصابة وإخفاء مثبطات تمديد محور عصبي المرتبطة الحطام المايلين والندبة الدبقية 1 ، 3 . على الرغم من هذا، والقدرة على تجديد محاور عصبية طويلة إلى أهداف بعيدة وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية المناسبة لا تزال محدودة للغاية 4 ، </sup> 5 ، 6 ، 7 .
في العمل الحالي، وتستخدم ميكروبادس، ميكرومانيبولاتيون ماصة، وأجهزة ميكروفلويديك لبدء بسرعة، واستطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن الخرز بولي-D- يسين المغلفة (بدل الخرز) للحث على التصاق الغشاء تليها تجميع المجمعات الحويصلة متشابك وتشكيل بوتونسابتيك بوريسينابتيك وظيفية 8 . وقد تبين أيضا أنه عندما يتم سحب PDL- حبة ميكانيكيا بعيدا بعد التمايز بريسينابتيك، وتتبع كتلة البروتين متشابك حبة، الشروع في نيوريت جديد 9 . الإجراء التالي يستغل هذه الحقيقة جنبا إلى جنب مع القدرة على ثقافة الخلايا العصبية قرن آمون الجنينية من الفئران في المناطق المنظمة على ساترة باستخدام بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) الأجهزة ميكروفلويديك على وجه التحديد جدد أسلاك العصبيةدائرة كهربائية.
هذه الأجهزة ميكروفلويديك بدمس غير سامة، شفافة بصريا وتتكون من غرفتين متصلة بواسطة نظام ميكروشانلز. مرة واحدة تجميعها على ساترة، كل جهاز بمثابة قالب لتوجيه نمو الخلايا العصبية والحفاظ على الثقافات العصبية صحية على أنماط دقيقة لمدة أطول من 4 أسابيع في المختبر .
هنا، يتم عرض الإطار الذي للتحقيق في حدود التمديد والوظائف من نيوريت جديدة. يتم إنشاء نيوريتس جديدة وظيفية ووضعها على كونترولابيلي (إعادة) شبكات الأسلاك العصبية. معدلات التمديد التي تحققت هي أسرع من 20 ميكرون / دقيقة على مسافات ملليمتر ملليمتر والتوصيلات الوظيفية. هذه النتائج تظهر، بشكل غير متوقع، أن القدرة الذاتية لهذه نيوريتس لاستطالة هو أسرع بكثير مما كان يعتقد سابقا. ويتجاوز هذا النهج الميكانيكي المقترح استراتيجيات كيميائية بطيئة ويتيح الاتصال المراقب لهدف محدد. ثهو تقنية يفتح آفاقا جديدة للدراسة في المختبر من العلاجات الجديدة لاستعادة اتصال الخلايا العصبية بعد الإصابة. كما أنه يتيح التلاعب وإعادة ربط شبكات الخلايا العصبية للتحقيق في الجوانب الأساسية لمعالجة الإشارات العصبية وظيفة الخلايا العصبية في المختبر .
باستخدام ميكرومانيبولاتيون القياسية والأجهزة ميكروفلويديك مبتكرة، تم تطوير تقنية جديدة للبدء بسرعة، استطالة ودقة ربط جديد الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات كبيرة. ميكرومانيبولاتيون ماصة هو أداة مشتركة في معظم مختبرات علم الأعصاب 4 ، <sup clas…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر يواشي مياهارا للعديد من المناقشات المفيدة والرؤى. ما و بغ تعترف بتمويل من نسيرك.
Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |