Este procedimento descreve como iniciar rapidamente, estender e conectar neurites organizados em câmaras microfluídicas usando pérolas revestidas de poli-D-lisina fixadas em micropipetas que guiam o alongamento de neurites.
Lesões do cérebro e da medula espinhal podem levar à incapacidade permanente e à morte, porque ainda não é possível regenerar os neurônios em longas distâncias e reconectá-los com precisão com um alvo apropriado. Aqui, um procedimento é descrito para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em longas distâncias. As taxas de extensão alcançadas atingem mais de 1,2 mm / h, 30-60 vezes mais rápido do que as taxas in vivo dos axônios de crescimento mais rápido do sistema nervoso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 vezes mais rápido do que o relatado anteriormente para o mesmo Tipo neuronal em um estágio anterior de desenvolvimento 4 . Em primeiro lugar, as populações isoladas de neurônios do hipocampo de ratos são cultivadas por 2-3 semanas em dispositivos microfluídicos para posicionar com precisão as células, possibilitando uma fácil micromanipulação e reprodutibilidade experimental. Em seguida, as pérolas revestidas com poli-D-lisina (PDL) são colocadas em neurites para formar contatos de adesivoOs atos e a micromanipulação de pipeta são usados para mover o complexo resultante do bead-neurite. À medida que o talão é movido, ele tira um novo neurite que pode ser estendido sobre centenas de micrômetros e funcionalmente conectado a uma célula alvo em menos de 1 h. Este processo permite reprodutibilidade experimental e facilidade de manipulação, ignorando estratégias químicas mais lentas para induzir o crescimento de neurites. As medidas preliminares aqui apresentadas demonstram uma taxa de crescimento neuronal muito superior aos fisiológicos. A combinação dessas inovações permite o estabelecimento preciso de redes neuronais em cultura com um grau de controle sem precedentes. É um método inovador que abre a porta a uma infinidade de informações e insights sobre a transmissão e comunicação de sinais dentro da rede neuronal, além de ser um campo de jogos para explorar os limites do crescimento neuronal. As aplicações e experiências em potencial são generalizadas com implicações diretas para terapias que visam reconectar a neuronaL após trauma ou em doenças neurodegenerativas.
As lesões do sistema nervoso central do adulto (SNC) podem levar à incapacidade permanente devido a múltiplos mecanismos que limitam o crescimento do crescimento axonal 1 . Após a lesão, muitos axônios do SNC não formam um novo cone de crescimento e não conseguem montar uma resposta regenerativa efetiva 2 . Além disso, danos e tecido cicatricial que envolvem lesões do SNC inibem significativamente o crescimento axonal 1 , 2 , 3 . As terapias atuais para promover a regeneração do SNC após a lesão se concentraram no aumento do potencial de crescimento intrínseco do neurônio lesado e no encobrimento dos inibidores da extensão axonal associada aos detritos de mielina e à cicatriz glial 1 , 3 . Apesar disso, a capacidade de regenerar axônios longos para alvos distantes e formar sinapses funcionais adequadas permanece severamente limitada 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
No presente trabalho, micrometras, micromanipulação de pipeta e dispositivos microfluídicos são usados para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em longas distâncias. O trabalho anterior mostrou que os grânulos revestidos com poli-D-lisina (pílulas PDL) induzem a adesão da membrana seguido pelo agrupamento de complexos de vesículas sinápticas e a formação de boutons presinápticos funcionais 8 . Também foi demonstrado que, quando o retículo PDL é mecanicamente puxado após a diferenciação pré-sináptica, o conjunto de proteína sináptica segue o grânulo, iniciando um novo neurite 9 . O procedimento a seguir explora esse fato, juntamente com a capacidade de cultura de neurônios embrionários do hipocampo de ratos em regiões organizadas em uma lamínula usando dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) para recarregar precisamente um neurônioo circuito.
Estes dispositivos microfluídicos PDMS são não tóxicos, transparentes opticamente e consistem em duas câmaras conectadas por um sistema de microcanais. Uma vez montado em uma lamínula, cada dispositivo serve como um molde para orientar o crescimento neuronal e manter culturas neuronais saudáveis em padrões precisos por mais de 4 semanas in vitro .
Aqui, é apresentada uma estrutura para investigar os limites de extensão e funcionalidade do novo neurite. Novites neurites funcionais são criados e posicionados para controlar (re) redes neuronais de rede controláveis. As taxas de extensão alcançadas são mais rápidas do que 20 μm / min em distâncias de escala milimétrica e as conexões funcionais são estabelecidas. Estes resultados mostram, inesperadamente, que a capacidade intrínseca desses neurites para o alongamento é muito mais rápida do que se pensava anteriormente. Esta abordagem mecânica proposta ultrapassa as estratégias químicas lentas e permite a conexão controlada a um alvo específico. ºA técnica abre novos caminhos para o estudo in vitro de novas terapias para restaurar a conectividade neuronal após a lesão. Também permite a manipulação e reconexão de redes neuronais para investigar aspectos fundamentais do processamento de sinal neuronal e função neuronal in vitro .
Usando micromanipulação padrão e dispositivos microfluídicos inovadores, uma nova técnica foi desenvolvida para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em grandes distâncias. A micromanipulação de pipeta é uma ferramenta comum na maioria dos laboratórios de neurociência 4 , 13 . O verdadeiro desafio para alcançar resultados reprodutíveis e confiáveis foi a padronização de culturas neuronais saudáveis …
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Yoichi Miyahara por muitas discussões e informações úteis. MA e PG reconhecem o financiamento do CRSNG.
Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
#5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |