Une approche rationalisée de dépistage de l'expression des protéines membranaires recombinantes dans Escherichia coli basée sur la fusion de la protéine fluorescente verte est présenté.
La production de protéines membranaires recombinantes pour des études structurelles et fonctionnelles reste techniquement difficile en raison de faibles niveaux d'expression et l'instabilité inhérente de nombreuses protéines membranaires fois solubilisé dans les détergents. Un protocole est décrit qui combine le clonage indépendant de la ligature de protéines membranaires sous forme de fusions de GFP avec l'expression dans Escherichia coli détectées par fluorescence de la GFP. Cela permet à la construction et l'expression de dépistage de la protéine de membrane multiples / variantes pour identifier les candidats appropriés pour plus d'investissement de temps et d'efforts. Le rapporteur GFP est utilisé dans un criblage primaire de l'expression par la visualisation de la fluorescence de la GFP suivant gel de Polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). Les protéines membranaires qui présentent à la fois un niveau d'expression élevé avec un minimum de dégradation, comme indiqué par l'absence de GFP libre, sont sélectionnés pour un criblage secondaire. Ces constructions sont mises à l'échelle et une fraction membranaire totale préparés et solubiliserd dans quatre détergents différents. Suite à une ultracentrifugation pour éliminer le matériau insoluble de détergent, des lysats sont analysés par chromatographie d'exclusion de taille de détection de fluorescence (FSEC). Le suivi du profil d'exclusion de taille par fluorescence de la GFP fournit des informations sur la mono-dispersité et l'intégrité des protéines membranaires dans des détergents différents. Protéines: combinaisons de détergents qui se éluent avec un pic symétrique avec peu ou pas de droits GFP et l'agrégation minimale sont des candidats pour une purification ultérieure. En utilisant la méthodologie ci-dessus, l'expression hétérologue dans E. coli du SED (forme, l'allongement, la division et la sporulation) protéines de 47 espèces différentes de bactéries a été analysée. Ces protéines ont typiquement dix domaines transmembranaires et sont essentiels pour la division cellulaire. Les résultats montrent que la production des SED orthologues chez E. coli était très variable en ce qui concerne les niveaux d'expression et l'intégrité des protéines de fusion GFP. L'expérience iindéterminés un sous-ensemble pour complément d'enquête.
Il a été estimé que les protéines membranaires représentent environ 20 à 30% des gènes codés dans tous les génomes séquencés 1, y compris le génome humain 2. Compte tenu de leur rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, par exemple le transport des métabolites, la production d'énergie et comme cibles pour les médicaments, il ya un intérêt intense dans la détermination de leur structure tridimensionnelle. Toutefois, par rapport à des protéines solubles, des protéines membranaires sont très sous-représentées dans la Protein Data Bank. En fait, des 99 624 structures libérés dans l'APB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) seulement 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) sont classés comme des protéines membranaires. Cela reflète les difficultés techniques de travail avec les protéines membranaires qui sont naturellement exprimés à des niveaux relativement bas; rhodopsine est l'un des quelques exceptions 3,4. La surexpression de version recombinantes dans des cellules hétérologues se traduit souvent par mauvais repliement et mauvais ciblage à la membrane qui limite le niveau global de la production. Le choix du meilleur détergent pour l'extraction et la solubilisation d'une protéine de membrane, une fois exprimé rend difficile la purification subséquente et nécessite une optimisation minutieuse.
Escherichia coli reste hôte d'expression la plus couramment utilisée pour des protéines membranaires représentent 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) des structures résolu à ce jour qui sont presque exclusivement à partir de sources bactériennes. E. spécifique souches coli, C41 (DE3) et C43 (DE3), ont été isolés qui ne conduisent pas à la sur-expression de protéines membranaires et donc d'éviter les effets de la toxicité observé pour les autres souches BL21 5,6. Réglage du niveau d'expression recombinante de la protéine de membrane semble être critique pour optimiser le niveau de production de 6,7.
<p class="Jove_content"> Dans de nombreux cas, la production réussie de protéines membranaires pour la détermination de la structure a nécessité l'évaluation de plusieurs versions dont deletions amino- et carboxy-terminales, de multiples orthologues d'exploitation de la variation de séquence naturelle et différentes protéines de fusion 6-8. Par conséquent, un procédé pour le criblage d'expression de plusieurs protéines de la membrane en parallèle est essentielle. Une méthode couramment utilisée consiste à fusionner la protéine à la protéine fluorescente verte (GFP) expression permettant d'être suivis sans la nécessité de purifier la protéine. De cette façon, des informations sur le niveau d'expression, la stabilité et le comportement dans différents détergents peut être évaluée avec de petites quantités de matière non purifiée 9-12.Dans cet article, on décrit un protocole simplifié pour le clonage et l'expression criblage de protéines membranaires dans E. coli en utilisant la fusion à la GFP en tant que journaliste de la production et la caractérisation ultérieure de détergent: protéines compLexes (figure 1).
Dans le protocole décrit dans cet article, la ligature indépendante clonage dans un vecteur rapporteur GFP est combiné à détection de fluorescence pour cribler rapidement l'expression relative de plusieurs protéines membranaires en E. coli. Vecteurs peuvent être faites dans les quatre jours ouvrables avec le dépistage d'expression primaire de prendre une semaine supplémentaire. En-gel fluorescence de lysats détergentes de cellules entières est utilisé pour classer expression frappe pour une analyse ultérieure dans un écran secondaire. L'écran d'expression tel que présenté primaire ne nécessite pas d'équipement spécialisé en dehors d'un incubateur agitateur approprié pour la croissance des cellules dans des blocs de puits profonds. Toute autre manipulation impliquant liquide à 96 puits des plaques SBS peut être effectuée en utilisant des pipettes multicanaux. Le protocole peut être facilement modifié pour inclure d'autres souches de E. coli cultivées dans différentes conditions d'expression (par exemple de température basse). Dans le cas de la LEMO21 (DE3) en titrant le niveau de rhamnose (de 0 à 2,0 mM)ajouter à moduler le taux de transcription peut augmenter le niveau d'expression de certaines protéines de la membrane 7. Détergents autres que DDM pourraient être utilisés pour l'extraction dans l'écran principal si détergents plus sévères peuvent solubiliser les protéines des corps d'inclusion et donc donner des faux positifs. De toute évidence, la plus élaborée l'écran initial devient, le plus de temps l'expérience.
L'écran secondaire consiste à préparer une fraction membranaire totale des résultats d'expression identifiés dans l'écran principal. Ce est une étape critique car il confirmera la localisation des protéines de fusion à la membrane du E. cellules de E. coli. Extraction ultérieure de la protéine de fusion GFP dans différents détergents est suivie par chromatographie d'exclusion de taille de la fluorescence détectée de matériau solubilisé pour évaluer la mono-dispersité des complexes détergent-protéine. Ce est une autre étape cruciale car elle identifie le détergent le plus approprié poursolubilisation de la protéine de membrane pour le traitement ultérieur en aval. Toutefois, l'expérience montre que l'optimisation du choix de la lessive (s) peut encore être nécessaire pendant la purification et la cristallisation. Preuve d'un comportement uniforme dans différents détergents, y compris celles qui ont une taille relativement petite de micelles (par exemple LDAO) semble être un bon indicateur de la propension à former ainsi diffracter cristaux au moins pour des protéines membranaires procaryotes 14. En ce qui concerne le profil indiqué pour la protéine de membrane sur la figure 2B semble très favorable.
Le principal avantage d'utiliser un rapporteur GFP est qu'il donne une lecture rapide de l'expression dans des échantillons de l'ONU-purifié. Un inconvénient est que la protéine de fusion GFP doit être éliminé au cours de la purification de la protéine pour la cristallisation. Dans le cas de vecteurs utilisés ici, un site de protease 3C du rhinovirus permet le clivage de la GFP. En variante, il est facilede re-clone protéines candidates, identifiés dans l'écran, dans des vecteurs qui ne ajoutent une polyhistidine ou autre marqueur d'affinité pour la purification ultérieure. Cela suppose que la fusion de GFP ne est pas nécessaire pour l'expression. La principale alternative à l'utilisation fusion à la GFP pour la détection de l'expression de protéine de la membrane et la solubilisation est d'ajouter seulement un marqueur d'histidine. Toutefois, cette approche nécessite en général à partir d'une fraction de membrane 15 qui, pour l'évaluation de nombreux variants deviendrait beaucoup de temps.
En résumé, l'objectif principal du protocole décrit dans cet article est de permettre à un grand nombre de séquence de la protéine de la membrane variantes être évalués rapidement en termes d'expression et de solubilisation avec un détergent et de priorités pour une analyse plus approfondie.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |