Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em> Escherichia coli</em

1. Konstruktion von Expressionsvektoren Verwenden PCR Infusion Klonen parallel mit den Vektoren pOPINE-3C-GFP und popin-N-GFP, die entweder spaltbare C-terminalen oder N-terminalen GFP-His6 Fusionen zu den Sequenzen 13 bzw. in den zu 96 Expressionsplasmide konstruieren up. Anmerkung: Die Wahl des Vektors wird durch die Topologie des Proteins diktiert, da die GFP muss im Cytosol exprimiert werden, wodurch die für ein Protein mit einer zytosolischen N-Terminus und C-Terminus der extrazellulären wir POPIN-N-GFP und verwenden würden einer extrazellulären N-Terminus und C-Terminus cytosolischen in wir pOPINE-3C-GFP verwenden würden. Wo beide Enden sind cytosolische wir pOPINE-3C-GFP verwenden würde, es sei denn funktionellen Gründen nicht auf den C-Terminus zu markieren. Verstärken die DNA-Sequenzen, die Membranproteine ​​mit Primern unter Einbeziehung folgender gezeigt Erweiterungen Codierung: pOPINE-3C-GFP (Forward Primer – AGGAGATATACCATG; Rückwärtsprimer – CAGAACTTCCAGTTT) und popin-N-GFP (Vorwärtsprimer – AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; Rückwärtsprimer – ATGGTCTAGAAAGCTTTA). Analyse der PCR-Reaktion durch Agarose-Gelelektrophorese. Einmal sauber PCR-Produkte erhalten wurden, fügen Sie 5 U DpnI in jede Vertiefung (Make-up in 5 ul 1x DpnI Reaktionspuffer). Aufreinigung der PCR-Produkte unter Verwendung von magnetischen Kügelchen in eine 96-Well-Format. Hinweis: DpnI hinzugefügt, um die Vorlage Vektor zu entfernen; Dieser Schritt ist nicht notwendig, wenn genomische DNA als Matrize verwendet. 1 ul (100 ng) des geeigneten linearisierten Vektor an jede Vertiefung einer PCR-Platte. Mit einer Mehrkanalpipette Add x ul des gereinigten PCR-einfügen in die entsprechenden Vertiefungen des PCR-Platte. Stellen Sie sicher, dass alle Produkte im Bereich von 10 bis 250 ng. Hinzufügen (9-x) & mgr; l Wasser zu dem gut und übertragen die gesamte 10 ul zu einem Röhrchen, das die Austrocknungs in-Fusions Reagenz. Lassen Sie für 30 Sekunden. Mischen Sie Inhalte kurz durch Auf- und Abpipettieren. Transferdie Reaktionen wieder auf den ursprünglichen PCR-Platte und Dichtung. Inkubieren für 30 min bei 42 ° C in einem Thermocycler. Die Reaktionen auf Eis sofort übertragen, sobald die Reaktion vollständig ist, und fügen Sie 40 ul TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Frieren Sie auf einmal oder zu transformieren in kompetente Zellen. Für die Transformation verwenden 3 ul der verdünnten Reaktions pro 50 ul-Aliquot hohe Kompetenz (> 5 x 10 9 Transformanten / ug) kompetente E. coli-Zellen. 1 ml LB-Agar mit 50 ug / ml Carbenicillin pro Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte ergänzt (für das Klonen, bereiten Brunnen für 2 x Anzahl der Konstrukte). Nach Auswachsen, Nach-Auswuchs Platte aus 25 ul und 25 ul einer 1: 5 Verdünnung der Kultur auf dem Agar-24-Well-Gewebekulturplatten. Verbreiten Sie die Zellen durch leichtes Kippen der Platte. Die Platte mit dem Deckel off für 10-15 Minuten bei 37 ° C oder in einem flow Abzug bei Raumtemperatur. Setzen Sie den Deckel und drehen Sie die Platte auf den Kopf und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Wählen Sie zwei Kolonien und Mini-Prep die Vektoren. PCR überprüfen Sie die Konstrukte mit dem Konstrukt spezifische Reverse-Primer und einen Vektor spezifischen Vorwärtsprimer (zB pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG). 2. Transformation von E. E-coli-Stämme xpression Anmerkung: Vor der Durchführung dieses Protokolls E. coli-kompetente Zellen werden hergestellt, aliquotiert und bei -80 ° C eingefroren, wie zuvor beschrieben 13. Membran-Protein-Expression wird routinemäßig in zwei Stämme gescreent Lemo21 (DE3) und C41 (DE3) pLysS. Zur Interpretation der Ergebnisse helfen kann es hilfreich sein, eine positive Kontrolle, beispielsweise ein Plasmid, die GFP oder ein Membranprotein mit GFP fusioniert bekannt zu äußern und einen leeren Vektor Negativkontrolle einzubeziehen. Auftauen aliquotted E. coli auf Eis. In 3 ul Mini vorbereitet Expressionsplasmid zu jedem Aliquot kompetenter Zellen. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 30 min. Hitzeschock der Zellen für 30 Sekunden bei 42 ° C. Sodass die Zellen auf Eis für 2 Minuten zu erholen, und dann werden 300 ul Kraftbrühe in jedes Röhrchen. Inkubieren für 1 Stunde in einem 37 ° C statischen Inkubator. Vorbereiten des LB-Agar in einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 50 ug / ml Carbenicillin und 35 ug / ml Chloramphenicol ergänzt. Hinzufügen Rhamnose zu einer Endkonzentration von 0,25 mM zu den Vertiefungen, die Lemo21 (DE3). Hinweis: Wenn das Produkt wahrscheinlich toxisch die Vertiefungen mit C41 zu sein (DE3) pLysS mit 1% (w / v) Glucose ergänzt werden. Transfer 30 ul Zellen aus dem Transformationsgemisch auf LB-Agar-Platten. Verbreiten Sie und trocknen Sie die Platte nach 1,13-1,15 beschrieben. 3. Herstellung der Übernachtung Starterkulturen <p class= "Jove_content"> Hinweis: Immer Übernachtkulturen nach der Transformation noch nie von einem alten Transformationsplatte bereiten den Tag. Hinzufügen von 0,7 ml Netz Brühe in jede Vertiefung einer 96-well Deepwell-Platte mit 50 ug / ml Carbenicillin und 35 ug / ml Chloramphenicol ergänzt. Hinzufügen Rhamnose in die Vertiefungen enthaltenden Lemo21 (DE3) bis zu einer Endkonzentration von 0,25 mM. Optional ergänzen C41 (DE3) pLysS mit 1% (w / v) Glucose; siehe oben (2.6) verbindlich. Wählen Sie eine Kolonie von den über Nacht Transformationsplatten in jede Vertiefung. Verschließen Sie den Block mit einem gasdurchlässigen Dichtung. Rütteln des Blocks bei 250 Upm in einem Inkubator mit einer großen Wurf (zB ein 25 mm Umlaufbahn) oder mit 600 Upm in einem Inkubator mit einer geringen Schwingbewegung (zB 4,3 mm Bahn) bei 37 ° C über Nacht. 4. Wachstum und Induktion der Kulturen 3 ml Kraftbrühe mit 50 ug / ml Carbenicillin und 35 ug / ml Chloramphenicol zu jedem w ergänztell der 24-Loch-Deepwell-Platte. In L-Rhamnose (und Traubenzucker), wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Verwenden Sie 3 ml Kultur bis zur Ernte in zweifacher Ausfertigung zu ermöglichen und für einige Verdunstung von Wasser durch die gasdurchlässige Dichtung zu ermöglichen. Bis die Expressionskulturen durch Zugabe von 150 ul Lemo21 (DE3) oder C41 (DE3) pLysS Übernachtkulturen in jede Vertiefung der 24-Loch-Deep-Well Blöcke gesetzt. Schütteln Sie die Blöcke bei 37 ° C, bis die mittlere OD bei 595 nm ist ~ 0,5 durch die Platte. Induzieren die Expression durch Zugabe von IPTG zu den Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM IPTG. Wachsen die Kulturen über Nacht (18-20 Stunden) bei 20 ° C schüttelnd. 5. Analyse der Expression von In-Gel-Fluoreszenz Ernte in zweifacher Ausfertigung. 1 ml der Kultur aus jeder Vertiefung in ein Quadrat gut, konischer Boden, 96-Loch-Deep-Well-Block. Hinweis: Ernte in zweifacher Ausfertigung bei Bruch des Blocks oder die Erprobung eines alternati ermöglichenve Reinigungsmittel, falls gewünscht. Abdichten der Blöcke und Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min. Kehren Sie die Block und dekantiert die Medien. Tippen Sie auf den Block vorsichtig auf ein Papiertuch, Stoffreste abtropfen lassen. Dichten Sie die Platten und bei -80 ° C für mindestens 20 min. Wahlweise lassen das Experiment an dieser Stelle und das verarbeitete wenn bequem Block. De-Frost die Pellets für 20 min bei Raumtemperatur. Entweder eine Mehrkanalpipette oder eines Orbitalschüttler (1.000 Upm für 10 min) bei 4 ° C, um die Zellen vollständig in 200 ul Lysepuffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl 10 mM Imidazol 1% v resuspendieren / v Tween 20, des pH auf 8,0 unter Verwendung von NaOH einzustellen). Mit 20 ul der DLPI Lösung (20 & mgr; l DNase I (4.000 Einheiten / ml), 20 mg Lysozym und 20 & mgr; l Protease-Inhibitor-Cocktail in einem Endvolumen von 2 ml Wasser). Inkubieren für 10 min unter Schütteln (~ 1000 rpm) bei 4 ° C. <li> Hinzufügen von 25 ul 10% n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM). Inkubieren für 60 min unter Schütteln (~ 1000 rpm) bei 4 ° C. Zentrifuge die Tief-Well-Block mit 6000 xg für 30 min bei 4 ° C. Transfer 10 ul des geklärten Lysats, um eine Mikrotiterplatte und gibt 10 ul SDS-PAGE-Gel-Ladepuffer (100 mM Tris, pH 6.8, 4% w / v SDS, 0,2% w / v Bromphenol blau, 10% v / v β -Mercaptoethanol und 20% v / v Glycerol). VORSICHT! Nicht kochen die Probe. Last 10 ul Probe aus Schritt 5.11 / Vertiefung auf SDS PAGE-Gel (e) und führen bei 100-120 V (konstante Spannung) in einen kalten Raum bis die Farbstoff-Front den Boden (2-2,5 h) erreicht. Legen Sie das Gel auf einem Bildwandler (zB mit einem Blaulicht-Filter, um die GFP-Fusionsproteine ​​zu erkennen). Die Belichtungszeit wird so gewählt, dass die hellsten Bänder nicht gesättigt. 6. Scale-up von Zellkulturen Verwandeln Sie ein Aliquot zuständigen <em> E. coli, wie in Kapitel 2 beschrieben. Wählen Sie eine Kolonie in 10 ml Kraftbrühe (ergänzt, wie in Kapitel 3 beschrieben) und über Nacht wachsen bei 37 ° C. 5 ml der Übernacht-Kultur in 500 ml Kraftbrühe. Wachsen unter Schütteln bei 250 Upm bei 37 ° C, bis die OD bei 595 nm von ~ 0,5. Induzieren die Expression durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM. Wachsen über Nacht unter Schütteln bei 250 Upm bei 20 ° C. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 15 min. Überstand verwerfen. Zellpellets bei -80 ° C gelagert werden. 7. Herstellung von Membranen Tau-Zellen (falls nötig) bei Raumtemperatur und resuspendieren in 1x PBS, pH 7,5, in einem Volumen von 5 ml pro Gramm Zellpellet; Lautstärke erhöhen wie nötig, bis die Viskosität reduziert, um eine laufende Konsistenz. Hinzufügen MgCl 2 bis zu einer Endkonzentration von 1 mM, DNAse I bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml und einemabgepackte Proteaseinhibitor Tablette pro 20 g Zellpellet. Brechen Sie Zellen unter Verwendung eines gekühlten Zelle Disruptor bei einem Druck von 30 kpsi. Pellet die nicht aufgebrochenen Zellen und Trümmer bei 30.000 g für 15 min bei 4 ° C. Überstand in einem Ultrazentrifugenröhrchen. Sammeln Sie den gesamten Membranfraktion durch Abzentrifugieren des Überstandes in einer Ultrazentrifuge bei 200,000 × g für 1 h bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Re-suspend die Membran Pellet in eiskaltem 10 ml PBS, pH 7,5, mit einem Zell Homogenisator. Für jedes Reinigungsmittel werden 1 ml resuspendiert Membranen erforderlich. Optional kann in diesem Stadium, Flash Einfrieren der Membransuspension in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. 8. Solubilisierung und Analyse der Membranfraktion Tau-Membranfraktion (falls erforderlich), und für jede Reinigungsmittel für die Solubilisierung verwendet werden aliquote 900 ul der Membransuspension in ein 1,5 ml Polyallomer-Mikro centrifuge Rohr. Füge 100 ul jeder frisch hergestellten Waschmittel (10% w / v Lösung von DDM, DM, Cymal-6 und LDAO) zu einer Endkonzentration von 1% zu der angegebenen 1,5-ml-Röhrchen. Zur Solubilisierung der eukaryontischen Membranproteine ​​Cholesterinhemisuccinat (0,2% Endkonzentration) kann den Waschmitteln zugesetzt werden. Die Gemische Inkubieren bei 4 ° C für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. Pellewaschmittel unlöslichen Fraktion mit einer Tischultrazentrifuge, wodurch Rohre mindestens halb voll, bei 150000 g bei 4 ° C für 45 min und der Überstand behalten. Anmerkung: Die Wirksamkeit der Waschmittel Solubilisierung unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät durch Messen der GFP-Fluoreszenz der solubilisierten Membranen mit dem Waschmittel unlöslichen Fraktion in dem gleichen Volumen von PBS resuspendiert abschätzen. Analyse der Monodispersionsgrad der verschiedenen Waschmittel: Membranproteinkomplexen unter Verwendung von Fluoreszenz-erfassten Größenausschlusschromatographie (FSEC). Für FSEC Analyse äquilibrieren eine Grßenausschlusssäule mit breiter Fraktionierungsbereich, zB 5.000 bis 5.000.000 Molekulargewicht, mit Laufpuffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) bei einer Flussrate von 0,3 ml / min . Verwenden dieses Puffers für alle Proben, dh es ist nicht für jeden getesteten Waschmittel verändert. Injizieren 100 ul solubilisierter Membranen auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min. Überwachen Elutionsprofil mit Fluoreszenzoptik (Anregung bei 488 nm und Emission bei 512 nm). Wenn ein Inline-Fluoreszenz-Monitor nicht verfügbar ist, sammeln die Fraktionen und lesen Sie die Fluoreszenz in einem Plattenlesegerät. Import Elutionsvolumen und die Fluoreszenzintensität von Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm zur grafischen Darstellung. Analyse verbleibenden solubilisierten Membranmaterial durch in-Gel-Fluoreszenz, wie in Abschnitt 5 beschrieben.