膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em>エシェリヒア·コリ</em

発現ベクターの1の構築使用するPCR輸液配列13それぞれに切断可能なC末端またはN末端 ​​のHis6-GFP融合物のいずれかを追加するベクターpOPINE-3C-GFPとPOPIN-N-GFPを用いて、並列に96発現プラスミドまで構築するためにクローニング。 注：GFPは細胞質ゾル中で発現する必要があるので、ベクターの選択は、タンパク質のトポロジーによって決定され、したがって、細胞質N末端 ​​および細胞外C末端を有するタンパク質を我々はPOPIN-N-GFPとのために使用し細胞外のN末端および細胞質C末端は、年にはpOPINE-3C-GFPを使用します。両方の末端が細胞質ゾルであるがC末端にタグ付けしない機能的な理由がない限り、我々はpOPINE-3C-GFPを使用します。 示され、以下の拡張機能を組み込んだプライマーを用いて膜タンパク質をコードするDNA配列を増幅する。 pOPINE-3C-GFP（フォワードプライマー – AGGAGATATACCATG、プライマーリバース – CAGAACTTCCAGTTT）とPOPIN-N-GFP（フォワードプライマー – AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG、プライマーリバース – ATGGTCTAGAAAGCTTTA）。 アガロースゲル電気泳動によるPCR反応を分析します。一度きれいなPCR産物が得られている、（1×をDpnI反応緩衝液5μlで構成する）を各ウェルに5 UのDpnIを追加します。 96ウェル形式で、磁気ビーズを使用してPCR産物を精製する。 注：DpnIをテンプレートベクトルを除去するために添加される。ゲノムDNAを鋳型として使用される場合は、このステップは不要である。 PCRプレートの各ウェルに、適切な線状化ベクターを1μl（100ngの）を追加します。 マルチチャンネルピペッターを使用して、精製したPCRのμlの追加x PCRプレートの適切なウェルに挿入します。すべての製品が10〜250 ngの範囲内にあることを確認してください。 ウェルに水の（9-X）μLを加え、ドライダウンで融合試薬を含むチューブに全体の10μLを転送する。 30秒間のままにしておきます。 ピペッティングにより簡単に内容物を混合。転送元のPCRプレートシールに対する反応。 サーモサイクラー中で42℃で30分間インキュベートする。 とすぐ反応が完了すると、氷に反応を転送し、40μlのTE（10mMトリス、pH8.0,1mMのEDTA）を添加する。 一度にフリーズしたり、テント細胞に形質転換する。形質転換のために、高い能力の50μlのアリコート当たり希釈した反応の3μL（> 5×10 9の形質転換体/μgの）テントE.を使用coli細胞 。 （クローニングのために、構築物2 x個、ウェルを調製）を、24​​ウェル組織培養プレートのウェルを50μg/ mlのカルベニシリン当たり添加したLB寒天培地を1ml加える。 成長板の後、成長を次のうち25μlを、24ウェル組織培養プレートを含む寒天上に培養の1~5倍希釈液25μl。 優しくプレートを傾けることによって、細胞を広げた。 37℃でのまたはフロで10-15分間、蓋をオフにして、プレートを乾燥させる室温でWフード。 蓋を交換し、逆さまにプレートを回し、37℃で一晩インキュベートする。 2コロニーとミニプレップのベクトルを選択してください。 PCRは、構造物の特定のリバースプライマーとベクター特異的フォワードプライマー（ 例えば pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTAタグのGG）を使用して、構文を確認してください。 E. 2.変容大腸菌のE XPRESSION株 注：前にこのプロトコルを実行するには、E。大腸菌コンピテント細胞を作製等分し、以前に記載13のように-80℃で凍結保存される。膜タンパク質の発現は、日常的に二つの株、Lemo21（DE3）およびC41（DE3）pLysS中でスクリーニングされる。結果の解釈を支援するためには、陽性対照、 例えば 、GFPを発現するプラスミドまたは発現することが知られているGFPに融合した膜タンパク質と空のベクターネガティブコントロールを含むように役立ちます。 アリを解凍quotted E.氷の上で大腸菌 。コンピテント細胞の各アリコートにミニプレップ発現プラスミドの3を添加する。 30分間氷上でミックスをインキュベートします。 42℃で30秒間の細胞を熱ショック。 細胞は2分間氷上で回復した後、各チューブに電力ブロス300μlのを追加することができます。 37℃の静的なインキュベーター中で1時間インキュベートする。 50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールを補充した、24ウェル組織培養プレートにLB寒天を準備する。 Lemo21（DE3）を含むウェルに0.25 mMの最終濃度にラムノースを追加します。 注：製品はC41（DE3）pLysS株を含有するウェルを1％（w / v）のグルコースを補充することができる毒性である可能性がある場合。 LB寒天プレート上に形質転換混合物からの細胞の30μlのを転送します。 1.13から1.15に記載されているようにプレートを広げ、乾燥させます。 一晩スターター培養物の調製<p class= "jove_content"> 注：常に古い形質転換プレートから変換後に一日一晩培養を決して準備していない。 50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールを補充した96ウェルディープウェルプレートの各ウェルに0.7ミリリットル電力ブロスを加える。 0.25mmの最終濃度にLemo21（DE3）を含むウェルにラムノースを追加します。必要に応じて、1％（w / v）のグルコースC41（DE3）pLysS株を補完する。上記（2.6注）を参照してください。 各ウェルに一晩形質転換プレートから1コロニーを採取。ガス透過性のシールでブロックをシール。 37℃で一晩小投（ 例えば 4.3ミリメートル軌道）で大投（ 例えば 25ミリメートル軌道）で、またはインキュベーターで600rpmでインキュベーター中で250rpmでブロックを振る。 4.成長と文化の誘導電力ブロス3mlを各50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールワットを補充追加24ウェルディープウェルプレートのエル。セクション3.1で説明したようにL-ラムノース（およびグルコース）を追加します。重複して収穫を可能にするために培養物を3mlを使用して、ガス透過性シールを通る水の一部の蒸発を可能にする。 24ウェルディープウェルブロックの各ウェルにLemo21（DE3）またはC41（DE3）pLysSを一晩培養の150μlのを追加することによって、発現培養を設定します。 595nmの平均ODがプレートを通して〜0.5になるまで37℃でブロックを振る。 1.0mMのIPTGの最終濃度まで培養物にIPTGを添加することにより発現を誘導する。 20℃で振とうしながら一晩培養物（18〜20時間）成長。 ゲル内蛍光によって発現の5.分析重複して収穫。平方よく、円錐底、96ウェルディープウェルブロックに、各ウェルからの培養の譲渡1ミリリットル。 注：収穫ブロックの破損の場合は、二重にまたはalternatiのテストを可能にする必要に応じて洗剤VEの。 ブロックを密封し、10分間6000×gでの遠心分離によって細胞を回収。 ブロックを反転し、メディアをデカント。残りのメディアを排出するためにペーパータオルの上に静かにブロックをタップします。 20分の最低-80℃でプレートや店舗を密封。必要に応じて、この時点での実験で便利な処理されたブロックを残す。 室温で20分間ペレット化し、デフロスト。 溶解緩衝液（50mMのNaH 2 PO 4、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、1％vの200μlの完全に細胞を再懸濁し、4℃で、マルチチャンネルピ ​​ペットまたはオービタルシェーカー（10分間、1000rpmで）のいずれかを使用/ vのトゥイーン20、NaOHを用いてpHを8.0に調整する）。 DLPI溶液20μl（20μlのDNアーゼI（4000単位/ ml）、20mgのリゾチーム、および水2mlの最終容量20μlのプロテ​​アーゼ阻害剤カクテル）を加える。 4℃で（〜1000回転）しながら10分間インキュベートする。 <li> 25の10％ずつのn -ドデシルβ-D-マルトシド（DDM）を追加します。 4℃で（〜1000回転）しながら60分間インキュベートする。 遠心機で4℃で30分間6000×gでディープウェルブロック。 マイクロタイタープレートへの転送をクリア溶解液を10μlおよびSDS PAGEゲルローディングバッファー（100 mMトリス、pH6.8の10μlの、W / SDS V 4％、0.2％W / Vブロモフェノールブルー、10パーセント（v / v）のβを追加メルカプトエタノール、および20％（v / v）のグリセロール）。 注意！ SAMPLEを沸騰しないでください 。 負荷ステップ5.11からサンプルを10μl/ウェルのSDS PAGEゲル（S）上に、色素フロントが下（2〜2.5時間）に達するまで寒い部屋の中で100〜120 V（定電圧）で動作します。 （GFP融合タンパク質を検出するために、青色フィルタを例 ）イメージャ上にゲルを配置する。露光時間は、明るいバンドが飽和されないように選択される。 細胞培養の6スケールアップ有能なのアリコートを変換する<em> E。セクション2に記載された大腸菌のように。 （セクション3で説明したように補足した）電力ブロスの10ミリリットルにコロニーを採取し、37℃で一晩成長する。 500ミリリットルパワーブロス中に一晩培養の5ミリリットルを希釈する。 595nmのODが〜0.5になるまで37℃で、250rpmで振とうしながら成長する。 1.0 mMの最終濃度までIPTGを添加することにより発現を誘導する。 20℃で、250rpmで振とうしながら一晩増殖。 15分間5000×gでの遠心分離により細胞を回収。 上清を捨てる。細胞ペレットを-80℃で保存することができる。 膜の7。準備細胞ペレットのグラム当たり5ミリリットルの容量で1×PBS pH7.5中、室温で解凍し、再懸濁細胞（必要な場合）。粘度が鼻水一貫性に減少するまで、必要に応じて音量を上げます。 10μg/ mlの一つの最終濃度が1 mMの、DNアーゼIの最終濃度までのMgCl 2を追加細胞ペレットを20g当たりプロテアーゼ阻害剤錠剤をあらかじめパッケージ。 30 KPSIの圧力で冷やした細胞破壊を使用して開いた細胞を破壊。 4℃で15分間、30,000 gで破壊されていない細胞と破片をペレット化。超遠心チューブに上清を移し。 4℃で1時間20万×gで超遠心上清をスピンダウンすることにより、総膜画分を収集する。 上清を捨てる。 細胞ホモジナイザーを用いて氷冷した10mlのPBS pH7.5中膜ペレットを再懸濁する。 1mlの再懸濁させた膜を、各洗浄剤のために必要とされる。必要に応じて、この段階では、フラッシュは-80℃で液体窒素とストア内の膜懸濁液を凍結する。 膜画分の8溶化および分析解凍膜画分（必要な場合）、各洗浄剤のための可溶化のために使用される、1.5ミリリットル中に膜懸濁液のアリコートを、900μlのポリアロマーマイクロcentrifuGEチューブ。 指定された1.5ミリリットルチューブに1％の最終濃度にそれぞれ新たに調製された洗剤を100μl（10重量％/ DDM、DMのVソリューション、Cymal-6およびLDAO）を追加します。真核生物の膜タンパク質のコレステロールヘミスクシネート（0.2％最終濃度）の可溶化のための界面活性剤に添加することができる。 穏やかに撹拌しながら1時間4℃での混合物をインキュベートする。 45分間、4℃で15万グラムで、確実にチューブが少なくとも半分フルである、ベンチトップの超遠心機と洗剤不溶性画分をペレットおよび上清を保持します。 注：界面活性剤可溶化の効果は、同じ容量のPBS中に再懸濁させ、界面活性剤不溶性画分と可溶化した膜のGFP蛍光を測定することにより、蛍光プレートリーダーを用いて推定することができる。 蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーを用いて膜タンパク質複合体（FSEC）：異なる界面活性剤の単分散性を分析する。 FSEC分析のために、広い画範囲を有するサイズ排除カラムを平衡化し、分子量5,000,000 例えば 5000、0.3ml /分の流速で緩衝液（20mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、0.03％DDM）を実行すると。それは試験した各洗剤のために変更されない。すなわち、すべてのサンプルについてこのバッファを使用します。 /分0.3ミリリットルの流量でカラムに可溶化された膜を100μl注入する。蛍光光学系（488 nmでの励起および発光512 nmで）を使用した溶出プロファイルを監視します。インライン蛍光モニターを使用できない場合は、画分を回収し、プレートリーダーで蛍光を読み取る。 グラフィック表示のための表計算プログラムにインポート溶出量と蛍光強度データ。 項5に記載のようにゲル内蛍光によって残りの可溶化された膜材料を分析する。