막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em> 대장균</em

발현 벡터의 1. 건설 사용하여 PCR 주입 서열 13 각각에 절단 가능한 C 말단 또는 N 말단 GFP-을 His6 융합체를 추가 벡터 pOPINE-3C-GFP 및 POPIN-N-GFP를 이용하여 병렬로 96 발현 플라스미드까지 구축 클로닝. 주 : GFP가 세포질에서 발현 될 필요가 보낸 벡터의 선택은 이와 세포질 N 말단 세포 외 C 말단 우리 POPIN-N-GFP 및 대한을 사용 가진 단백질, 단백질의 토폴로지에 의해 결정되고 세포 외 N 말단과 세포질 C 말단은 우리가 pOPINE-3C-GFP를 사용합니다. 두 말단이 세포질 어디 C- 말단에 태그를하지 기능 이유가없는 한 우리는 pOPINE-3C-GFP를 사용합니다. 도시 확장명 혼입 프라이머 막 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 증폭 : pOPINE-3C-GFP (정방향 프라이머 – AGGAGATATACCATG는 프라이머 역 – CAGAACTTCC을AGTTT)과 POPIN-N-GFP (정방향 프라이머 – AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG은 – ATGGTCTAGAAAGCTTTA) 프라이머 역. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 반응을 분석한다. 일단 깨끗한 PCR 제품이 얻어졌다 (1 배 DpnI 반응 버퍼의 5 μL 메이크업) 각 웰에 5 U DpnI를 추가합니다. 96- 웰 포맷으로 자성 비드를 이용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 참고 : DpnI 템플릿 벡터를 제거하기 위해 추가됩니다 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 경우이 단계가 필요하지 않습니다. PCR 플레이트의 각 웰에 적절한 선형화 된 벡터의 1 μL (100 NG)를 추가한다. 정제 된 PCR ㎕의 멀티 채널 피펫 추가 X를 사용하여 PCR 플레이트의 적절한 우물에 삽입합니다. 모든 제품은 10-250 NG의 범위에 있는지 확인하십시오. 우물의 물 (9-X) μl를 추가하고 건조 다운에서 융합 시약을 포함하는 튜브에 전체의 10 μl를 전송합니다. 30 초 동안 그대로 둡니다. 피펫 팅 아래로 간단히 내용을 섞는다. 이전원래 PCR 플레이트와 실에 반응. 열 순환기에 42 ° C에서 30 분 동안 품어. 즉시 TE 40 μl를 반응이 완료되는 즉시 얼음에 반응을 전송하고 추가 (10 mM 트리스, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA). 한 번에 동결 또는 관할 세포로 변환. 변환의 높은 역량의 50 μL 나누어지는 (> 5 × 10 9 형질 전환 / μg의) 능력 E. 당 희석 된 반응의 3 μl를 사용 대장균 세포. LB 한천 배지 1 ㎖를 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 당 웰의 24 웰 조직 배양 플레이트로 보충 추가 (클로닝, 구조의 2 × 번호 웰을 준비). 생장 플레이트 후, 생장을 따라 밖으로 25㎕를 24 웰 조직 배양 플레이트를 함유하는 아가 상에 배양 한 5 희석액 25 μL. 부드럽게 판을 기울여 세포를 확산. 37 ° C 또는 플로에 10 ~ 15 분 동안 뚜껑 접시를 건조실온에서 w 후드. 뚜껑을 교체하고 거꾸로 판을 켜고 밤새 37 ° C를 품어. 두 식민지와 미니 준비 벡터를 선택합니다. PCR은 구조 특정 역방향 프라이머 및 벡터 특정 정방향 프라이머 (예 pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA 태그 GG)를 사용하여 구조를 확인합니다. E. 2. 변환 대장균 E의 XPRESSION 변종 참고 : 이전에이 프로토콜, E.을 수행하기 대장균 유능한 세포를 만든 분주 이전 13 설명 ​​된대로 -80 ° C에서 냉동 저장됩니다. 막 단백질 발현이 정기적으로 두 균주에서 상영되어, Lemo21 (DE3)과 C41 (DE3) pLysS를. 결과의 해석을 돕기 위해 그것을 예 양성 대조군, GFP 발현 플라스미드 또는 발현하는 것으로 알려져 GFP 융합 세포막 단백질과 빈 벡터 대조군을 포함하는 것이 도움이 될 수있다. 알리 해동quotted E. 얼음에 대장균. 유능한 세포의 각 나누어지는에 미니 수험 공부를 발현 플라스미드의 3 μl를 추가합니다. 30 분 동안 얼음에 믹스를 품어. 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 열 쇼크. 세포가 2 분 동안 얼음에 복구하고 각 튜브에 전원 국물의 300 μl를 추가 할 수 있도록 허용. 37 ° C 정적 배양기에서 1 시간 동안 품어. 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린과 35 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 보충, 24 웰 조직 배양 플레이트에서 LB 한천을 준비합니다. Lemo21 (DE3)를 함유하는 웰에 0.25 ㎜의 최종 농도 람노 추가. 참고 제품 C41을 함유하는 웰에 독성이있을 가능성이있는 경우 (DE3) pLysS를 1 % (w / v) 글루코오스로 보충 될 수있다. 전송 LB 아가 플레이트 상에 형질 전환 혼합물로부터 세포의 30 μL. 확산 및 1.13-1.15에 설명 된대로 판을 건조. 박 스타터 문화 3. 준비 <p class= "jove_content"> 참고 : 항상 오래된 변환 판에서 결코 변환 후 하룻밤 문화에게 일을 준비합니다. 50 ㎍ / ㎖의 카르 베니 실린과 35 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 보충 96 웰 깊은 웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml의 전원 국물을 추가합니다. 0.25 mM의 최종 농도 Lemo21 (DE3)를 함유하는 웰에 추가 람노. 선택적으로, 1 % (w / v)의 글루코스 C41 (DE3) pLysS를 보충; 위 (2.6 주)를 참조하십시오. 물론 각에 하룻밤 변환 판에서 하나의 식민지를 선택합니다. 가스 투과성 씰 블록을 밀봉합니다. 하룻밤 37 ° C에서 작은 던져 (예 : 4.3 mm 궤도)와 인큐베이터에 큰 던져 (예를 들어 25mm 궤도) 또는 600 rpm에서와 배양기에서 250 rpm에서 블록을 흔들어. 4. 성장과 문화의 유도 전원 국물의 3 ㎖를 각각 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린과 35 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 w 보충 추가24 잘 깊은 웰 플레이트의 엘. 3.1 절에 설명 된대로 L-람 노스 (포도당)를 추가합니다. 중복에 수확을 할 수 있도록 문화의 3 ㎖를 사용하여 가스 투과 실을 통해 물이 일부 증발을 허용 할 수 있습니다. 24 잘 깊은 잘 블록의 각 웰에 Lemo21 (DE3) 또는 C41 (DE3) pLysS를 하룻밤 문화의 150 μl를 추가하여 식 문화를 설정합니다. 595 nm에서의 평균 OD 때까지 37 ° C에서 블록을 흔들어는 ~ 판을 통해 0.5입니다. 1.0 mM의 IPTG의 최종 농도로 배양 물에 IPTG를 첨가하여 발현을 유도한다. 20 ℃에서 진탕 배양 하룻밤 (18 ~ 20 시간)을 성장. 에 – 겔 형광에 의한 표현의 5. 분석 중복에 수확. 광장 아니라, 원뿔 바닥, 96 웰 깊은 잘 블록에 각 웰에서 문화의 양도 1 ml의. 주 : 추수 중복 블록 또는 파손시의 교류 직류 시험을 허용원하는 경우 세제를했습니다. 블록을 밀봉하고 10 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확. 블록 전환과 미디어를 가만히 따르다. 남은 용지를 배출 종이 타월 위에 가볍게 블록을 누릅니다. 20 분 이상 동안 -80 ℃에서 저장 판 봉쇄. 선택적으로,이 시점에서 실험 때 편리 처리 블록을 떠난다. 실온에서 20 분 동안 펠릿 드 로스트. 용해 완충액 (50 mM의에 NaH 2 PO 4, 300 mM의 NaCl을 10 mM의 이미 다졸, 1 % (V)의 200 μL 완전히 세포를 재현 탁 4 ° C에서 멀티 채널 피펫 또는 진탕 기 (10 분 동안 1,000 RPM)를 사용하여 / V 트윈 20) NaOH를 사용하여 8.0으로 산도를 조정합니다. (물 2 ㎖의 최종 부피 20 μL DNaseI (4000 단위 / ㎖), 20 mg의 라이소자임, 2​​0 μL 프로테아제 억제제 칵테일) DLPI 20 μL의 용액을 추가한다. 4 ℃에서 (~ 1,000 RPM)을 진탕 10 분 동안 품어. <li> 10 % N -Dodecyl의 β-D-말토 (DDM)의 25 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 (~ 1,000 RPM)을 진탕 60 분 동안 품어. 원심 분리기 4 ° C에서 30 분 동안 6,000 XG에 깊은 웰 블록. 마이크로 타이 플레이트에 분해물의 10 μl를 전송 및 SDS PAGE 겔 로딩 버퍼 (100 mM 트리스, 산도 6.8, w 4 %의 10 μl를 추가 / SDS V, 0.2 % w 브로 모 페놀 블루, 10 % V / V의 β V / 머 캅토 에탄올, 20 % v / V를 글리세롤).주의! 샘플을 끓여하지 마십시오. 로드 단계 5.11에서 시료 10 μL / 웰 SDS 페이지 젤 (들) 상 및 염료 전면 하단 (2-2.5 시간)에 도달 할 때까지 차가운 방에서 100 ~ 120 V (정전압)에서 실행합니다. (GFP 융합 단백질을 검출하는 푸른 빛 필터 예 :) 이미 저에 젤을 놓습니다. 노출 시간은 밝은 밴드가 포화되지 않도록 선택된다. 세포 배양 6. 스케일 업 관할의 나누어지는 변환 <em> E. 대장균은 2 절에서 설명. (3 절에 설명 된대로 보충) 전원 국물 10 ㎖에 식민지를 선택하고 37 ° C에서 하룻밤 성장. 500 ml의 전원 국물에 하룻밤 문화의 5 mL를 희석. 595 nm에서 OD 때까지 37 ° C에서 250 rpm으로 진탕 성장은 ~ 0.5입니다. 1.0 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 발현을 유도한다. 20 ° C에서 250 rpm으로 진탕 하룻밤 성장. 원심 분리하여 수확 세포를 15 분 동안 5,000 XG에. 취소 상층 액. 세포 펠렛을 -80 ℃에서 보관 될 수있다. 막 7. 준비 세포 펠렛의 g 당 5 ㎖의 부피로 1X PBS pH가 7.5을 실온에서 해동하고 재현 탁 세포 (필요한 경우); 점도가 콧물 일관성에 감소 할 때까지 필요에 따라 볼륨을 높입니다. 10 ㎍ / ㎖의 하나의 최종 농도 1 mM의,의 DNase I의 최종 농도의 MgCl 2를 추가세포 펠릿 20g 당 프로테아제 억제제 타블렛 사전 패키지. 30 KPSI의 압력에서 냉장 세포 장애 물질을 사용하여 열려있는 세포를 휴식. 4 ℃에서 15 분 동안 30,000g에서 끊어지지 세포와 파편 펠렛. 초 원심 분리 튜브에 뜨는을 전송합니다. 4 ° C에서 1 시간 동안 20 만 XG에서 초 원심 분리기에서 상층 액을 회전시켜 총 막 분획을 수집합니다. 상층 액을 제거한다. 세포 균질기를 사용하여 빙냉 PBS 10 ㎖의 pH 7.5에서의 막 펠렛을 다시 일시. 막 재현 탁 1 ml를 각각의 세제가 필요합니다. 선택적으로,이 단계에서, 플래시는 -80 ℃에서 액체 질소에 저장 막 현탁액을 동결. 막 분획 8. 가용화 및 분석 해동 막 분획 (필요한 경우), 각각의 세제가 용해에 사용하는, 1.5 ml의 막으로 현탁액의 분취 량 900 ㎕를 마이크로 polyallomer centrifuGE의 튜브. 지정된 1.5 ㎖의 튜브에 1 %의 최종 농도로 각각의 새로 제조 된 세제를 100 μL (10 % w / DDM, DM의 V 솔루션 Cymal LD​​AO-6)을 추가한다. 진핵 세포 막 단백질 콜레스테롤 헤 미숙시 네이트 (0.2 % 최종 농도)의 가용화 세정제에 첨가 할 수있다. 가벼운 교반과 함께 1 시간 동안 4 ° C에서 혼합물을 품어. 45 분 동안 4 ° C에서 150,000g에서 보장 튜브가 적어도 절반 가득, 벤치 탑 초 원심 분리기와 세제 불용성 부분을 펠렛과 상층 액을 유지합니다. 주 : 세제 가용화 효과는 PBS의 동일 용적에 재현 탁 세제 불용성 분획으로 가용화 막 GFP 형광을 측정하여 형광 플레이트 판독기를 사용하여 추정 될 수있다. 다른 세제 모노 – 분산 분석 : 막 단백질 복합체 형광 감지 된 크기 배제 크로마토 그래피를 이용하여 (FSEC). FSEC 분석을 위해 / 분 0.3 ml의 유속으로 완충액 (20 mM 트리스 pH가 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 0.03 %의 DDM)를 실행하여, 분자량 5,000,000 넓은 분별 범위 크기 배제 칼럼, 예를 들어 5000 평형화 . 모든 샘플이 버퍼를 사용하여, 그것은 각 시험 세제 변경되지 않습니다 즉. / 분 0.3 ml의 유속으로 컬럼 상 가용화 된 막 100 ㎕를 주입한다. 형광 광학계 (488 nm에서 여기 및 512 nm에서 방출)을 이용하여 용출 프로파일을 모니터한다. 인라인 형광 모니터를 사용할 수없는 경우, 분획을 수집하고 플레이트 판독기에서 형광을 판독. 그래픽 디스플레이에 대한 스프레드 시트 프로그램으로 가져 용리 부피와 형광 강도 데이터. 섹션 5에 기술 된 바와 같이 겔의 형광에 의해 가용화 된 막 물질을 분석한다 잔존.