We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op anti-kankerbehandeling<em> In vivo</em> En cel resolutie.
De tumor micro speelt een centrale rol in tumorinitiatie, progressie, metastase, en respons op anti-kankertherapieën. Driedimensionaal co-cultuur systemen worden vaak gebruikt om tumor-stroma interacties, inclusief hun rol in drug reacties zjin. Echter, veel van de interacties die optreden in vivo in het intacte micro niet volledig worden gerepliceerd in deze in vitro instellingen. Zo heeft directe visualisatie van deze processen in real-time een belangrijk hulpmiddel bij het begrijpen tumor respons op therapie en identificatie van de interactie tussen kankercellen en het stroma dat deze reacties kunnen beïnvloeden. Hier geven we een methode om met draaiende schijf confocale microscopie van levende, verdoofde muizen direct observeren distributie van medicijnen, kanker cel responsen en veranderingen in tumor-stroma interacties na toediening van systemische therapie bij borstkanker modellen. We beschrijven procedures voor Labellng verschillende tumor componenten behandeling van dieren voor het waarnemen therapeutische respons en de chirurgische procedure voor het belichten tumorweefsels voor imaging tot 40 uur. De resultaten van dit protocol zijn time-lapse filmpjes, waarin dergelijke processen als medicijn infiltratie, het afsterven van kankercellen en stromale cel migratie kan worden geëvalueerd met behulp van beeldanalyse-software.
Vaste tumoren bestaan uit twee grote compartimenten: kankercellen en de stromale bestanddelen (zowel cellulaire en niet-cellulaire) die het behoud van een geschikte omgeving voor tumorgroei 1. Deze stromale bestanddelen spelen kritieke rollen in de ontwikkeling, progressie en metastase van vele soorten kanker, inclusief die van de borst 2-5. De stromale omgeving beïnvloedt ook de therapeutische respons 2,4,5. Aldus bepalen hoe kankercellen conventionele en nieuwe therapieën reageert binnen de context van het intacte micro is belangrijk voor de bevordering van ons begrip van kankerbiologie en verbeteren van de huidige therapeutische strategieën. Bovendien bepalen hoe kankercel-stroma interacties te veranderen na de toediening van de therapie is van cruciaal belang voor het begrijpen van de biologie van de tumor recidief.
Organotypische co-kweken systemen zijn nuttig voor het bestuderen van tumor-stroma interacties <sup> 6, maar het is duidelijk dat de methoden beschikbaar niet met succes herhalen de intacte tumor micro-omgeving in vitro, met name met betrekking tot vasculaire functie en rekrutering van immuuncellen. Inderdaad, kanker cel responsen op therapieën die in vitro waren ook sterk verschillen van die waargenomen in vivo, waarbij de micro intact 5. Zo kan in vivo modellen voor de studie van tumor-stroma interacties en hun impact op de therapeutische respons beter aansluiten bij klinisch relevante mechanismen 7.
De primaire middel voor het bestuderen reacties op anti-kankertherapie in vivo zijn door metingen van tumorgrootte en histologisch onderzoek van weefsels afkomstig van dieren of patiënten. Er zijn echter ontwikkelingen in de microscopie en fluorescentie verslaggevers in de afgelopen twee decennia kon de visualisatie van inter-en intracellulaire processenmet een hoge resolutie in levende, verdoofde dieren (intravitale imaging) 8. Deze intravitale microscopie technologieën hebben bewezen bijzonder waardevol voor ruimte en tijd ontleden van de in vivo dynamiek van tumor-stroma interacties op cellulaire en sub-cellulaire resolutie 8,9.
Processen die zijn ontrafeld door intravitale imaging omvatten anti-tumor T-cel cytotoxiciteit 10,11, interacties tussen T-cellen en myeloïde cellen 12, de dynamiek van veranderingen in collageen samenstelling en die na een therapeutische behandeling 13, macrofaag-afhankelijke kankercellen intravasatie en metastase 14 en vasculaire permeabiliteit 15.
Er zijn drie belangrijke eisen voor intravitale beeldvorming. Deze omvatten passende voorbereiding en de blootstelling van weefsels voor de beeldvorming, TL-etikettering van het weefsel componenten van belang, en een gepaarde microscopie-camera'system bouwen die beelden 16. De meest voorkomende strategieën gebruikt om deze eisen aan te pakken zijn onder meer: 1) heterotope preparaten (bijvoorbeeld inoculatie van het oor of oog orbitaal), permanente beeldvorming vensters of geëxterioriseerde preparaten (bijvoorbeeld, dorsale huid flap), 2) transgene fluorescerende verslaggevers en.. fluorescerende injectables om weefsel-componenten worden, en 3) multifoton of confocale microscopie systemen gecombineerd met fotomultiplicatorbuizen of charge-coupled device (CCD) camera's, respectievelijk 9. We maken gebruik van een chirurgisch voorbereide huid flap model om de lies borstklier bloot voor beeldvorming bij verdoofde dieren die transgenen die coderen voor fluorescerende verslaggevers uit te drukken. Beelden worden verkregen over een periode van 12 tot 40 uur met een geïntensiveerde CCD (ICCD) camera gekoppeld met vier draaiende schijf laser confocale microscoop systeem 17. Imaging op deze manier heeft ons toegestaan om dergelijke processen te bestuderen in vivo distributie van medicijnen, podium-afhankelijke chemotherapeutic reacties, type chemotherapie geïnduceerde celdood en myeloïde celgedrag 5.
Wij een protocol voor de intravitale beeldvorming van kanker cel responsen op anti-kankertherapie en tumor-stroma interacties in muismodellen van borstkanker. Dit protocol kan worden gebruikt om het gedrag en de dood van zowel kankercellen en stromale componenten met een grote verscheidenheid van transgene en injecteerbare fluorescente labels in zowel transgene en transplantatiemodellen voor een periode van maximaal 40 uur in een opnamesessie volgen.
De reacties van tumoren voor systemische therapieën in vivo kan sterk verschillen van die van kankercellen in vitro, aangezien de micro zowel de acute respons en recidief 5 beïnvloedt. Een van de grootste obstakels voor expliceren in vivo chemoresistentie paden is de complexiteit van de interacties tussen kankercellen en hun micro-omgeving. Met name omdat solide tumoren hebben een evenwicht tussen kankercellen en stromale cellen, verstoringen van een component, zoals celdood die optreedt tijdens antikankerbehandeling kan leiden tot dramatische gevolgen voor weefsel organisatie.
De intravitale beeldvormingstechniek die hier maakt de directe visualisatie van kankercel-stroma interacties in de tumoren van levende, verdoofde muizen tijdens de behandeling met anti-kanker geneesmiddelen. We maken gebruik van draaiende schijf confocale microscopie, die een relatief beperkte indringdiepte heeft (zie 17 </sup>), maar onze chirurgische en labeling techniek kan worden gebruikt met andere vormen van microscopie. Films verkregen uit deze experimenten kan worden gebruikt om processen die veranderingen in fluorescentie-intensiteit (bijvoorbeeld door infiltratie van een gemerkte populatie of inductie van celdood), celmotiliteit, verdeling van injectables (bijv. vasculaire lekkage sporen), en co-sporen omvatten lokalisatie van fluorescentiesignalen 5,12,17,20.
We routinematig beeld muizen voor meer dan 6 uur en ook uitgevoerd beeldvorming voor meer dan 18 uur. Dit vereist het handhaven van de muizen onder narcose continu voor deze lange tijdsperioden. Met de juiste verdoving, meer dan 90% van onze dieren te overleven 6 uur, en ongeveer 80% overleeft meer dan 18 uur. Details over hoe de lange termijn anesthesie uit te voeren zijn eerder 19 gepubliceerd. In onze ervaring, vijf factoren zijn van cruciaal belang: het vermijden van hypothermie, het vermijden van uitdroging, het onderhouden van fysiologische bloed zuurstof saturatie niveaus, uzingen bevochtigd draaggas voor isofluraan, en het houden van de dieren op het laagste niveau van de anesthesie, waarbij zij geen tekenen van pijn. Om lichaamstemperatuur houden we muizen in een verwarmde deken (bij 38 ° C). Om uitdroging te voorkomen, we injecteren van kleine hoeveelheden zout ip gedurende de gehele beeldvorming procedure. Om fysiologische bloed zuurstof saturatie op peil te houden, beginnen we met 21% zuurstof in het dragergas (in plaats van de gebruikelijke 100%). Dit stelt ons in staat om ingeademde zuurstof te verhogen als een muis – uren in een experiment – laat een daling zien in het bloed zuurstof verzadiging. In onze ervaring, het verhogen van de ingeademde zuurstof niveaus op een zodanig tijdstip (bijv. 30-40%) bijna altijd zullen stabiliseren het dier waardoor uur extra beeldvorming. Het optimale niveau van anesthesie is bereikt met de meeste muizen 1-1,5% isofluraan en resulteert in adem percentages 60-65/min en hartslag van 400-450/min. In onze beeldvorming experimenten hebben we voornamelijk gebruik van transgene muismodels (MMTV-PyMT en C3 [1]-Tag) waarin tumoren multifocale, waardoor beeldvorming van meerdere laesies in verschillende stadia van tumorprogressie in parallel op verschillende x, y posities tijdens een opnamesessie. Dit vermindert bezorgdheid over mouse naar muis variatie met betrekking tot experimenten gericht op het identificeren fase-afhankelijke therapeutische respons en vermindert het aantal dieren vereist voor imaging.
De MMTV-PyMT model (en andere spontane kanker modellen) gaan door middel van progressieve histopathologische fasen die kunnen worden herkend tijdens intravitale beeldvorming, hoewel de pathologische stadiëring van de tumor laesies die kunnen worden gedaan tijdens intravitale beeldvorming is anders, en minder gedetailleerd dan die van de histologische coupes 5,17. In tegenstelling, transplantatie modellen hebben de neiging om het beste weerspiegelen laat stadium tumoren, omdat de kankercellen meestal geïsoleerd van gevorderde tumoren. Dergelijke modellen zijn dus beter geschikt voor het bestuderen van tumor-stromainteracties van laat stadium tumoren dan verschillen in deze interacties tussen verschillende stadia.
We tonen voorbeelden van hoe je beeld nucleaire structurele veranderingen die zich voordoen na celdood geïnduceerd door therapie. Bij afwezigheid van anti-kankerbehandeling Deze strategie labeling plaats kan worden gebruikt om beelden celdeling in situ belichten, bijvoorbeeld hoe celproliferatie en dormantie wordt beïnvloed door de micro-omgeving. In de toekomst kunnen fluorescente labeling van mitochondriale componenten maken het mogelijk om beeld mitochondriale veranderingen tijdens apoptose.
In dit protocol hebben wij ook aangetoond voorbeelden van het beeld kankercel-immune cel interacties na de therapie, maar andere microenvironmental componenten kunnen worden gevisualiseerd en afgebeeld. Bestaande transgene reporter lijnen voor stromale componenten omvatten die voor fibroblasten (bijv.., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) of cellen van de vasculatuur (bijvoorbeeld Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Intravitale beeldvorming maakt het mogelijk om real-time visualisatie van de interacties en processen die zich voordoen in vivo volgende toediening van chemotherapie. Met de technologie die momenteel beschikbaar is, hebben we grote vooruitgang geboekt in het begrijpen hoe myeloïde cellen beïnvloeden therapeutische respons, maar omdat de tumor micro-omgeving is zo complex, grote vooruitgang is nog steeds noodzakelijk om te beginnen te mechanistisch verdiepen in de processen die ten grondslag liggen aan milieu-gemedieerde resistentie tegen geneesmiddelen. Een van de belangrijkste verbeteringen nog steeds nodig is de identificatie van betere markers voor specifieke celpopulaties. Het belang van een betere markers goed geïllustreerd met twee van de belangrijkste componenten stromale cellen van de borst tumor micro-omgeving fibroblasten en immuuncellen. α-gladdespieractine (αSMA) wordt vaak gebruikt om te identificerenfibroblasten, maar het eiwit wordt ook uitgedrukt door vasculaire gladde spiercellen en myo cellen 24. Dus, hoewel αSMA-GFP reporter muizen bestaan, het bepalen van de specifieke celtype dat volgende tijdens een intravitale imaging experiment is een uitdaging. Evenzo zal een fluorescerende marker zoals EGFP expressie gebracht onder de c-fms promoter geven vaak meerdere subpopulaties van immuuncellen 12,17. Ofschoon zou het liefst een marker om een specifiek celtype identificeren de complexiteit van de onderliggende biologie een belangrijke uitdaging in deze aanpak.
Een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem is injecteerbare labels gebruiken om verder te differentiëren subpopulaties van cellen die dezelfde fluorescerende reporter. Bijvoorbeeld worden fluorescerende dextranen opgenomen door macrofagen en kan worden gebruikt om de macrofaag subpopulaties die gelabeld door de c-fms-EGFP en Fsp1-EGFP transgene muizen reporter label <sup> 17. Antilichamen geconjugeerd met fluorescerende probes zijn ook gebruikt om specifieke deelpopulaties (bijvoorbeeld de Gr1-positieve populatie van myeloïde cellen gelabeld door de c-fms-EGFP reporter 17) te identificeren.
Anders tumor respons curven gegenereerd door caliper meting, die weinig mechanistische informatie over hoe of waarom tumoren reageren op de toegediende therapeutische of histologische reeksen uit weefsels geoogst op verschillende tijdstippen dat grote cohorten van dieren criteria beantwoorden, onze techniek levert rechtstreekse, kwantificeerbare informatie op de dynamiek van celdood en interacties van stromale cellen met kankercellen in kleine cohorten. Dus het voordeel dat de procedure die hier is dat het dynamische geneesmiddeleninfo reacties voorziet in de context van een intacte tumor micro-omgeving in real-time. Dergelijke informatie kan leiden tot belangrijke inzichten in de onderliggende processen die therapeutische respons te rijden 5 </ Sup>.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken J. Cappellani en J. Qiu voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de middelen van het National Cancer Institute (U01 CA141451), het Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen voor de Cure, Long Island 2 Dag Loop naar borstkanker, Manhasset Women's Coalition Against Breast Cancer met mij vechten, en een pre-doctorale beurs van de Congressionally Breast Cancer Research Program, VS ESNESN is ook de ontvanger van de Leslie C. Snel en William Randolph Hearst Stichting Fellowships van de Watson School of Biological Sciences. HAA werd ondersteund door middelen van de Noorse Raad voor Onderzoek (160698/V40 en 151882), en Zuidoost-Regional Health Authorities (2007060).
Reagent | |||
MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
1 x PBS | Made in-house | ||
2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
Nitrogen | |||
Oxygen | |||
Equipment | |||
18G x 1½” regular bevel needle | BD | 305196 | |
μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24×50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
Glass microscope slides | Corning | 2948-75×25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
Heated blanket | Gaymar Industries | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
Laboratory tape ( ½”) | |||
Laboratory tape (1″) | |||
Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1×2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4″ length |
Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4″ length |
Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾” ultra thin needle, 12″ tubing |
Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H |