乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

記載されている全ての手順はローカルインスティテュー動物実験委員会による事前の承認を含む脊椎動物の使用のためのガイドラインおよび規制に従って行わなければならない。 1。イメージング（トランスジェニックまたは同所）のマウス乳腺腫瘍を発生させる遺伝子改変マウスモデルを用いたイメージングのための乳腺腫瘍を発生させる（ 例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復[MMTV]オーマミドルT抗原[PyMT]またはラットC3（1）プロモーター、SV40のラージT抗原（タグ）を駆動[C3（ 1）タグ]モデル）または同所移植モデル（同系、同種、または異種）。 トランスジェニックレポーター株（ 例えば ACTB-ECFP）または原発性癌細胞又は移植に続く細胞株（ 例えば伝達） の ex vivo での操作を使用して遺伝子組み換えモデルを掛け合わせることによりラベルのがん細胞を。同所移植、sのサンプル·プロトコルのためのeeは18。 2。腫瘍微小環境またはサブ細胞成分の可視化コンポーネントトランスジェニックラベルを使用して腫瘍コンポーネントを視覚化する。トランスジェニックレポーターマウス（ 例えばc-FMS-EGFPの原子核の骨髄細胞またはACTB-H2B-EGFPの場合）または移植、標識された組織の受信者としてこのようなマウスを使用して遺伝子組み換え腫瘍モデルを交配。これは、それぞれ、細胞死に伴う治療や核変化に応じて、癌細胞間質細胞の相互作用の可視化を可能にします。 注射剤を使用して微小環境を可視化する。剤（ 例えば、蛍光標識された抗体又は化学染料）、多種多様な腫瘍の様々なコンポーネントにラベルを付けるために使用することができます。色素の半減期は、1つは追跡に興味を持っているの応答に応じて、注射は撮影開始前に投与してもよいし、イメージングセッション中に静脈内（IV）またはintのどちらかraperitoneally（IP。、 図1）。 3。顕微鏡やイメージングソフトウェア顕微鏡。顕微鏡システムおよびソフトウェアの様々な生きたマウスのイメージングのために使用することができます。最も一般的に使用されるシステムは、共焦点顕微鏡や多光子です。我々は、ICCDカメラ（XR-メガ10EX S-30、スタンフォードフォトニクス、パロアルト、CA）でマイクロレンズ付きスピニングディスク共焦点顕微鏡（Solamereテクノロジーズ、ソルトレイクシティ、ユタ州）を使用します。 イメージングソフトウェア。我々はオープンソースソフトウェアμManager（ヴァーレ研究所、カリフォルニア大学サンフランシスコ[UCSF]）を使用します。 画像解析。我々は、画像解析にImaris（ビットプレン）、Volocity（パーキンエルマー社）と、ImageJ（健康[NIH]総合研究所）を使用します。 4。イメージングのための動物の（前）処理鼠径部乳腺腫瘍は長径がキャリパーmeasurで約8mm以下を測定したときに我々のプロトコルを使用してイメージング用に最適であるement。 実験の必要に応じて、小分子阻害剤、抗体医薬や化学療法薬で治療イメージングの動物については、イメージングの前またはその間に治療を開始する。イメージングは​​化学療法薬ドキソルビシンによって誘導される細胞死のイメージングが最高のイメージング24時間を開始することで、捕獲されている間、（映画1と2）開始以降、薬物治療の後にされた後、例えば、薬剤溢出と分布のイメージングには、管理を必要とします（作品3および4）。 5。イメージング中に動物の水和と血液浸透圧を維持するための生理食塩水の準備 1ミリリットルのシリンジへの1X PBS約1mlを描画します。ヨウ化プロピジウム（PI、インビトロジェン、1 mg / mlの希釈、1時15分）が定期的にイメージングセッション中（IP）投与されるであろう、この溶液に添加することができる。これは、細胞膜透過性を持っている人が死亡または瀕死の細胞の核のイメージングを可能にする。 PIは非常に短いHALを持って血管系のf-生活、したがってイメージングセッション全体を再投与しなければならない。 このシリンジに翼の輸液セット（23ゲージ、¾インチ針、12インチチューブ）を取り付け、チューブの終わりに生理食塩水が終了した針の先端の一滴までチューブを通してソリューションを押してください。 輸液セット、および適切な食塩水を補充してからシリンジを取り外します。 ラインに気泡が混入しないように注意しながら、輸液セット、シリンジを再度取り付けます。 6。イソフルラン麻酔システムの整備噴霧器に水を加えて、所定の位置にねじ込みます。これは、動物に送達ガスを加湿する肺の炎症を防止し、長期的な麻酔下動物の生存を延長します。 一番上の行にイソフルランタンクを埋める。注意：イソフルランはまた、研究者に影響を与えることができる強力な麻酔薬である。適切な真空システムべきB過剰ガスが領域から削除されていることを確認するための場所で、電子。 酸素タンクと窒素タンクの両方をオンにして、流れを調整します。酸素は約0.2 L /分（〜21％）であるべきである一方、窒素は、約1.0 L /分であるべきである。 （インハウス）真空をオンにします。真空度は約1.2 L / minである必要があります。 誘導室へ麻酔のラインが開いていることを確認し、手術領域に線や顕微鏡が閉鎖されています。 麻酔システムに接続されたラテックス呼吸袋が膨張していることを確認します。バッグが膨らまない場合は交換します。 顕微鏡のステージおよび外科プラットフォームに麻酔を提供するノーズコーンのそれぞれのゴムダイヤフラムをチェックしてください。ゴムが薄いに開始している場合は、それを交換します。 7。手術道具と手術プラットフォームの準備ホットビーズ滅菌器の電源をオンにして、それが> 200℃に到達させ石鹸と水で手術器具を洗う（1鉗子[好ましくは歯を持つ]と動物の皮膚を切断するためのはさみ、鉗子の1ペア[好ましくは鋸歯状]と腫瘍のさらなる暴露用ハサミ）。 ホットビーズ滅菌器（あるいは、手術道具を事前にオートクレーブにかけることができます）を使用して、少なくとも30秒間、手術器具を滅菌する。 滅菌済みのツールを汚染しないよう確認しながら手術道具が冷えるましょう。 発泡スチロール出荷クーラーに蓋を収集します。これはあなたの手術プラットフォームになるだろう。 発泡スチロールの蓋（十分にそれをカバーする）の上にラボ浸すのピースを置きます。 接辞実験用テープを用いるラボ浸す（1〜麻酔システムへのラインとノーズコーン "のテープが一番ここで動作します）。、18G×1½挿入"を維持するためにノーズコーンのいずれかの側に発泡スチロールの蓋にテープを通して針をノーズコーンは、所定の場所に固定。 ベタジン、滅菌ガーゼ、2 70％イソプロパノールワイプ、顕微鏡を脇に置きますスライド、Krazyの接着剤、およびラボテープ4個（½ "の幅）。 8。顕微鏡の調製顕微鏡、カメラ、顕微鏡を実行しているコンピュータの電源をオンにします。 毛布の電源をオンにします。 倒立顕微鏡を使用する場合は、カスタムメイドステージインサートが鼠径部乳腺の位置に対応する撮影ポートを使用して設計されるべきである。ステージは、石鹸と水でよく乾燥した挿入清掃してください。イメージングポートを介してカバーガラス（＃1.5厚み）を確保し、70％イソプロパノールで表面全体をきれいにする（半 "は最高の作品）ラボのテープを使用してください。汚染から保護する滅菌ガーゼと一緒にステージをカバー。ステージのステージインサートを置きそれは空気乾燥することができます。 、ラボテープの4から6個（1 "幅）を引き裂く、長さ約6インチと顕微鏡の側面に取り付けます。テープのこれらの作品は、動物に麻酔を提供するノーズコーンを配置するために使用されますdは、所定の位置に固定します。 長さ1インチ程度であるテープの2枚以上（½インチ幅）を引き裂く。これらは、マウスや場所に腫瘍を公開するために使用顕微鏡スライドにPBSを提供翼状針を維持するために使用されます。 9。イメージングのための鼠径乳腺をさらすキャリアガスとして酸素21％と窒素バランス（約1.0 L /分の流量）とイソフルラン4％を用いた誘導チャンバー内に動物を麻酔。これは、2月4日分を取る必要があります。 それが上を向いて腹面で、深くゆっくりと呼吸したら外科プラットフォームにマウスを移す。外科的なプ​​ラットフォームに麻酔ラインを開き、その後、麻酔システムにおける高すぎる圧力を回避するために、このためには、誘導室に麻酔ラインを閉じます。この時点で4％から2.5％にイソフルランの濃度を減少させる。 動物が十分anesであることを確認するために反射ペダル撤退をチェック蹠ピンチを行うことにより、外科手術用thetized。それは足蹠ピンチに（ 例えばけいれんや尻尾をカール）反応しない場合、動物は適切に麻酔をかける。動物が足蹠ピンチに反応しない場合、イソフルランの濃度を増加させる。 実験用テープで手術プラットフォーム（½ "テープこのために最高の作品）にマウスの手足を固定します。 動物が手術プラットフォームに固定したら（省略可能）、髪は電子シェーバーを使用して腹面から取り外すことができます。化学脱毛を優先する場合は、これは手術の前に24〜48時間を実行する必要があります。浮遊毛が強く、急性免疫応答を誘導することができるように、手術前に髪を削除すると、撮像部位の汚染を防止するのに役立ちます。 70％イソプロパノールワイプやベタジンで動物の腹面を消毒する。 滅菌はさみや鉗子（歯を持つ）の最初のペアを使用して、皮下腹側正中切開を作るそれは〜3ミリメートル尿道上から剣状突起まで実行されます。穿刺または腹膜切開を避けるために注意してください。 滅菌はさみや鉗子（鋸歯）の第二のペアを使用して、静かに腹腔から、接続されている鼠径乳腺で、肌をデタッチします。 顕微鏡スライドガラスを取り出し、前の手順で生成された皮膚のフラップに対して、それを配置します。マウスがステージ上に配置された後、腫瘍の大部分がフラットに座って、それが後肢の機動性を妨げないような方法でスライドを配置します。 顕微鏡スライドが適切に配置された後、瞬間接着剤（ 例えば 。、クレイジーグルー）を使用して皮膚の外表面にスライドを添付してください。 10。ステージ上にマウスを置く外科的なプ​​ラットフォームに動物の手足を固定している研究室のテープを取り外します。 顕微鏡ステージに麻酔ラインを開き、anestheを閉じるこの順序で手術プラットフォームにSIAライン、。 迅速顕微鏡ステージに動物を転送します。 一度動物は、転送された位置とマウスを麻酔したままで快適な位置にあることを確実にするために（ 例えばラボのテープを使用して）適切に麻酔ラインとノーズコーンを固定されています。 それが一番上と顕微鏡ステージでカバーガラスで覆われたイメージング·ポートの1つの中心に位置するように腫瘍を公開します。 接眼レンズを使用して、腫瘍が正しく配置されていることを確認し、ゆっくりと顕微鏡スライドダウンテープ。組織への血流が遮断されないように、スライドが緩く固定する必要があります。顕微鏡スライドを下にテーピングすると動物の呼吸によって導入された画像アーチファクトを最小限に抑えることができます。 翼の点滴と腹腔内留置線を挿入すると、＃5で調製滅菌1X PBSまたは生理食塩水を（必要に応じてこのようなPIとして色素を含む）を含む1mlのシリンジに取り付けセット。注射100μlのIPを動物に電気ショック療法。行が挿入されます。この時点からの撮影セッションが終了するまで、1時間間隔（またはPIの生理食塩水25μlの30分毎）に生理食塩水50μlと動物を注入します。 動物のバイタルサインを監視するには、オキシメータプローブ（スターライフサイエンス、株式会社などによるMouseOxシステム）19を添付してください 。 低体温症を防ぐために毛布を使用して、マウスをカバーしています。 11。画像の取得オープンソースソフトウェアμManager（ヴェールラボは、UCSF）のタイムラプス画像を取得するために使用されます。生データはImaris（ビットプレン）ソフトウェアでコンパイルされており、独立した観察者によって手動で得点、または（ 例えば Volocity [パーキン]またはImageJの[NIH]）のいずれかImarisまたは他の画像解析ソフトウェアで解析することができます。 12安楽死 画像セッション（1-4の終わりに0時間は、）は、分析プロセスの種類に応じて、動物を安楽死させています。 イソフルランの濃度が4％に上昇する。 それは呼吸を捕捉し、ステージから削除した後に動物が30秒になるまで観察される。 頸椎脱臼は、動物を安楽死されていることを確認するために実行されます。 13。代表的な結果それは腫瘍、治療処置後の細胞死、細胞死5に対応して、腫瘍間質の相互作用に達すると、この方法を用いて生体内イメージングは、腫瘍、血管外漏出や薬物の分布に薬物送達を含む様々なプロセスの直接可視化することができます。画像が取得されている間、腫瘍組織への血管外遊後の腫瘍とその分布への薬物の到着を観察するために、動物が注入される。 chのであるが、いくつかのクラスemotherapeuticsが（例えば、ドキソルビシンなど）が弱い蛍光性で、多くはそうではありません。蛍光共役デキストランは、組織への薬物送達および拡散のためのサロゲートマーカーとして使用することができます。 図2と映画1は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合静脈注射2 MDデキストラン（Invitrogen社、1 mg / mlの1xPBS）の到着を示しています。 ACTB-ECFPマウス; MMTV-PyMTの腫瘍へ。 腫瘍への薬物の到着後、組織を通して血管外漏出と拡散は、薬物と薬物分布5の両方の血管内半減期を決定するために撮像することができる。ムービー2は静脈注射のAlexa Fluor-647-共役10 kDのデキストラン（Invitrogen社、1×PBS中1 mg / ml）での血管外漏出と分布を示している。 ACTB-ECFP;、撮影時のc-FMS-EGFPマウスC3（1） – タグに変換します。 Imaris（ビットプレン）のタイムラプスムービーをコンパイルした後、血管内半減期および薬剤分布が定量化される。血管内半減期を測定するには、各時点での腫瘍血管の平均蛍光強度を計算し、時間に対してプロットされている。薬物分布は、薬物陽性である総腫瘍面積あたりのパーセント領域として定量化される。 腫瘍への薬物送達の動態を追跡するだけでなく、腫瘍が治療に反応する方法を決定するために頻繁に重要である。抗がん治療は、細胞死を誘導することが期待されているように、プロピジウムアイオダイド（PI）染色又は構造的核変化は薬剤誘発性細胞死5のマーカーとして使用することができる。 図3は、MMTVにおける細胞傷害性化学療法薬ドキソルビシンに対する腫瘍の反応を示しています-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPマウス。でこのトリプルトランスジェニックMMTV-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFP動物、ECFPラベル乳癌細胞（青）、およびEGFPラベル骨髄細胞（緑）。イメージングが始まったとPIはトン全体でIP配信される前に、このセッション中に撮像された動物は、ドキソルビシン18時間投与した彼は上記のようなイメージングセッション。癌細胞（ACTB-ECFPラベリング）は、青色で表示され、死者や死細胞は赤色（PI染色）として表示されます。ここに提示された時系列は、時間の経過とともにドキソルビシン依存性細胞死の誘導を示す。腫瘍における細胞死の誘導を定量化するために、薬物の分布を決定するために使用される分析、同じ種類の定量的な出力は、PI陽性である総腫瘍面積あたりのパーセント領域である場合、使用されています。 高倍率での撮像は、癌細胞が5を受けることが細胞死のタイプに関する情報を提供することができます。ムービー3は、ドキソルビシンと全身療法に応答してアポトーシスによる細胞死の典型的な核の変化を追跡するためのイメージング実験の結果を示しています。核を可視化するには、このセッション中に結像される動物が代わりにc-FMS-EGFPレポーターのACTB-H2B-EGFPレポーターを抱いて、癌細胞の核は緑色のラベルが貼られていますので。このMMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFPの動物は、admだったinisteredドキソルビシン（8 1 mg / kgのX PBS）の前ムービーの開始、およびPI（インビトロジェン、1 mg / mlの溶液を1:15希釈）を含む1×PBSの毎時注射を受けにIP（24時間）。癌細胞の核内構造変化が壊死（核形態に最小限の変更を表示するPI陽性細胞）を受けた細胞の隣にアポトーシス細胞で観察することができます。アポトーシス細胞の核は結局PI染色の取り込み（図示せず）に起因する赤になります。壊死とアポトーシス事象の数は、PI-陽性と核形態に基づいて、各時点のために手動で定量化される。 化学療法誘発性癌細胞死腫瘍2,4,5への免疫細胞の反応募集に頻繁に結果図4は、ドキソルビシンと急性期治療には、この間質反応の例を示しています。 MMTV-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物がここに結像されるドキソルビシン（8 1×PBS中のmg / kg）を腹腔内投与した</em>。約20時間前に撮影開始、と毎時のPI注射ip を受けています。細胞死を可視化する実験の期間中。時間はドキソルビシン治療後の時間数を表す示し、スケールバーは100μmを表しています。白矢印で示すように、この実験では、骨髄細胞は、細胞死の領域に潜入する。定量的な出力がEGFP陽性である総腫瘍面積あたりのパーセントの領域であるドキソルビシン投与後の腫瘍への骨髄細胞の浸潤、解析と同じ種類の薬物の分布を決定するために使用され、化学療法に対する腫瘍の反応が使用されているが、定量化する。 化学療法への全体的な質の応答を可視化することに加えて、専門的な間質応答も5可視化することができる。ムービー4は、隣接する細胞による壊死性細胞材料の食作用を示しています。赤核物質はラーグと細胞によって摂取されて見ることができますマクロファージの典型である電子無傷緑核、。 MMTV-PyMT; ACTB-ECFP、このセッション中に結像されるACTB-H2B-EGFPの動物は、ドキソルビシン（1×PBS中8 mg / kg）を腹腔投与した。ムービーの開始に先立って24時間。動物は、1×PBSを含む、PI（インビトロジェン、1 mg / mlの溶液を1:15希釈）の毎時の注射を受けた。核（ACTB-EGFP標識）が緑色で表示されますが、細胞が壊死すると赤に変わります。 図1。トランスジェニックと注射ラベルを使用して、異なる腫瘍コンポーネントのサンプルラベリングこれはトリプルトランスジェニックMMTV-PyMTです;。ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物癌細胞はECFPと骨髄細胞の発現を介して青のラベルが貼られていたが、ラベルが貼られています骨髄特異的プロモーターからEGFPの発現を介して緑色。動物中（PI、赤、1X PBSで〜0.07 mg / ml）をヨウ化プロピジウムを注射した細胞死を可視化するイメージングセッション。 PIのラベルは、DNAだけ死んだか瀕死の細胞膜を横切る。スケールバー=100μmである。 図2。腫瘍における薬剤溢出および配布この二重トランスジェニックMMTV-PyMT;がん細胞がECFPの発現を通して青のラベルが貼られていたACTB-ECFP動物がどのように可視化するイメージング·セッション中に、FITC結合2 MDデキストラン（緑）を注射した薬は静脈注射（青）の後に腫瘍に到達。イメージングが開始された後の時刻が表示されます。スケールバー=100μmである。 図3。全身療法に対する癌細胞応答。 MMTV-PyMT; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物は、化学療法で治療薬は前にイメージングにドキソルビシン、および細胞死にラベルを付けるために、PI（赤色、1X PBSで〜0.07 mg / ml）と注入された。この画像シリーズはドキソルビシン治療後の細胞死の誘導を表す、時間をかけてPI染色の蓄積を（白矢印で示すように）を示しています。示された時間は、ドキソルビシン治療後の時間です。画像はz軸の3つの画像を含むzスタックの最大強度予測されています。スケールバー=100μmである。 図4。 MMTV-PyMTで化学療法への骨髄細胞の応答; ACTB-ECFP;ますc-FMS-EGFP三重トランスジェニックマウスに投与する前にイメージングドキソルビシン20時間動物は毎時ipを受け取った。 PIの注射（赤、〜1X PBSで0.07 mg / ml）の死んだ細胞を標識する。この画像シリーズはdoxorubi以下の時間をかけてEGFP陽性骨髄細胞（白矢印）の蓄積を示していますCINの治療。この反応性免疫応答は4,5化学療法のいくつかのクラスに対する治療応答を阻害することが示されている。示された時間は、ドキソルビシン治療後の時間です。画像はz軸の3つの画像を含むzスタックの最大強度予測されています。スケールバー=100μmである。 ムービー1。 。がん細胞がECFPの発現を通して青のラベルが貼られていたACTB-ECFP動物、 腫瘍への薬物送達これは、二重トランスジェニックMMTV-PyMTです。動物薬は静脈注射後に腫瘍に到達する方法を可視化するイメージングセッション中に2 MD FITC結合デキストラン（緑）を注射した。スケールバー=100μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。 ムービー2。腫瘍組織への薬物浸透三重トランスジェニックC3（1）タグ; ACTB-ECFPと、c-FMS-EGFPの動物癌細胞がラされているECFPとEGFPの発現を介して緑色で標識された骨髄細胞の発現を介して、青色でbeledのAlexa Fluor 647-共役10 kDのデキストラン（赤）で静脈内注射した。視野は直ちにデキストランの注射の後に表示されています。デキストランは当初、血管系は、急速に腫瘍組織にextravasates、最後にマクロファージに取り込まれ、ラベルが付けられます。スケールバー=100μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。 ムービー3。 。ACTB-ECFP;、化学療法誘発性細胞死の後に核の変更このトリプルトランスジェニックMMTV-PyMT のイメージング H2B-EGFPの動物は、イメージングの前にドキソルビシンを注射した。としてH2B-EGFP融合タンパク質の発現によって追跡核の形態（緑）は、右上隅にある細胞に見られるように、アポトーシスの典型的な化学療法によって誘発される核の構造変化の直接可視化することができます。動物RECE半時間ごとにipを ived。死者や死細胞を標識するためのイメージングセッションの持続時間のためのPI（赤色）の注射。示された時間は、ドキソルビシン治療24時間後の時間です。画像は、高倍率の対物レンズ（40倍、NAは1.1、水レンズ）を使用して取得した。スケールバー=15μmで。 ムービーを見るにはここをクリック 。 ムービー4。核の変化や化学療法誘発性細胞死の後に死んだ細胞物質の取り込みのイメージングこのトリプルトランスジェニックMMTV-PyMT; ACTB-ECFP、H2B-EGFPの動物は、イメージングの前にドキソルビシンを注射した。としてH2B-EGFP融合タンパク質の発現によって追跡核の形態（緑）は、化学療法誘発核構造変化の直接可視化することができます。動物は半時間ごとにIPアドレスを取得しました。死者や死細胞を標識するためのイメージングセッションの持続時間のためのPI（赤色）の注射。画像を取得した高倍率の対物レンズ（40×、NAが1.1、水レンズ）を使用。前PIとGFPシグナルの核形態と損失の変化による標識に大きな構造変化の欠如が壊死様細胞死の指標である。死んだ材料は、マクロファージの典型である大核と細胞​​に取り込まれて見られている。示された時間は、ドキソルビシン治療24時間後の時間です。スケールバー=10μmである。 ムービーを見るにはここをクリック 。