חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד
Özet
אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד הסרטן<em> In vivo</em>, ברזולוציה של תא בודדה.
Abstract
גידול microenvironment תפקיד מרכזי בייזום בגידול, התקדמות, גרורות, ותגובה לטיפולים אנטי סרטניים. מערכות תלת ממדיות שיתוף התרבות משמשת לעתים קרובות כדי להסביר אינטראקציות גידול stroma, כולל תפקידם בתגובות לסמים. עם זאת, רב של אינטראקציות המתרחשות בגוף חי בmicroenvironment השלם לא יכול להיות משוכפל לחלוטין באלה בהגדרות חוץ גופייה. לפיכך, להדמיה ישירה של תהליכים אלה בזמן האמת הפכה לכלי חשוב בהבנת תגובות גידול לטיפולים וזיהוי יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וstroma שיכול להשפיע על תגובות אלה. כאן אנו מספקים שיטה לבאמצעות מיקרוסקופיה confocal דיסק המסתובבת של עכברים חיים, מורדמים להתבונן ישירות סמי הפצה, תגובות ושינויים באינטראקציות גידול stroma בעקבות ממשל של טיפול מערכתי במודלים של סרטן שד תאי סרטן. אנו מתארים נהלים לlabeliרכיבים שונים ng סרטני, טיפול בבעלי חיים להתבוננות תגובות טיפוליות, וההליך כירורגי לחשיפת רקמות סרטניות להדמיה 40 שעות. התוצאות שהתקבלו מפרוטוקול זה הן סרטי זמן לשגות, שבתהליכים כגון חדירת סמים, מוות של תאי סרטן ונדידת תאי סטרומה ניתן להעריך באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
Introduction
גידולים מוצקים מורכבים משני תאים עיקריים: תאים סרטניים ועל מרכיבי סטרומה (תאי ובלתי תאי) המסייעים בשמירה על הסביבה מתאימה לצמיחת גידול 1. מרכיבי סטרומה אלה לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות, ההתקדמות, וגרורות של סוגים רבים של סרטן, כוללים אלה של 2-5 שד. סביבת סטרומה משפיעה גם תגובות טיפוליות 2,4,5. לפיכך, קביעה כמה תאים סרטניים מגיבים לטיפולים קונבנציונליים ורומן בהקשר של microenvironment השלם חשוב לקידום ההבנה של ביולוגיה של הסרטן שלנו ושיפור אסטרטגיות טיפול נוכחיות. יתר על כן, ההגדרה כיצד אינטראקציות סרטן התאים stroma לשנות בעקבות מתן הטיפול היא קריטית להבנת הביולוגיה להשנות גידול.
מערכות Organotypic שיתוף culturing היו שימושיות לחקר אינטראקציות גידול stroma <sעד> 6, אבל ניכר שהשיטות הקיימות כיום אינם יכולות לסכם microenvironment השלם הגידול במבחנה, בעיקר ביחס לתפקוד כלי דם וגיוס של תאי מערכת חיסון בהצלחה. ואכן, תגובות תא סרטנית לטיפולים שהם נצפו במבחנה הן לעתים קרובות שונות באופן מהותיים מאלה שנצפו בחי, שבי microenvironment הוא ללא פגע 5. לפיכך, במודלי vivo לחקר אינטראקציות גידולי סטרומה והשפיע על תגובה לטיפול עשוי לשקף טוב יותר את המנגנונים רלוונטיים קליני 7.
האמצעי העיקרי של בחן את התשובות לטיפול נגד סרטן in vivo עבר מדידות של גודל גידול והערכה היסטולוגית של רקמות מקורם בבעלי חיים או חולים שטופלו. עם זאת, התקדמות במיקרוסקופ וכתבי ניאון בשני העשורים האחרונים אפשרה להדמיה של תהליכים תאיים והבינוברזולוציה גבוהה בבעלי חיים, מורדמים (intravital הדמיה) 8. טכנולוגיות מיקרוסקופיה intravital אלה הוכיחו להיות יקרים במיוחד למרחב ובזמן לנתח בדינמיקה של אינטראקציות vivo גידולי סטרומה ברזולוציה סלולרית והמשנה הסלולר 8,9.
תהליכים שכבר נפרמו על ידי הדמית intravital כוללים cytotoxicity נגד גידול התא T 10,11, אינטראקציות בין תאי T ותאי מיאלואידית 12, את הדינמיקה של שינויים בהרכב קולגן וארגון בעקבות טיפול רפואי 13, intravasation תא הסרטני macrophage התלוי וגרורות 14, וחדירות כלי דם 15.
יש שלוש דרישות עיקריות עבור הדמית intravital. אלה כוללים היערכות מתאימה וחשיפה של רקמות להדמיה, ניאון תיוג של הרקמה של עניין, ומיקרוסקופיה מצלמה לזווג שלystem מסוגל לרכוש תמונות 16. האסטרטגיות הנפוצות ביותר המשמשות לטיפול בדרישות אלו כוללות: 1) הכנות heterotopic (למשל, חיסון של אוזן או עין ההקפה), קבעה ההדמיה חלונות, או תכשירי exteriorized (למשל, דש עור גב), 2) כתבי ניאון ומהונדס.. הזרקת ניאון לתייג מרכיבי רקמות; ו3) מערכות מיקרוסקופיה multiphoton או confocal זיווג עם צינורות מכפילים או תשלום מצמידי התקנים (CCD) מצלמות, בהתאמה 9. אנו משתמשים במודל דש עור ניתוח מוכן לחשוף את בלוטת החלב מפשעתי עבור הדמיה בחיות מורדמות המבטאות transgenes קידוד כתבי ניאון. תמונות מתקבלות על פני תקופה של 12 עד 40 שעות באמצעות התעצם CCD (ICCD) מצלמה יחד עם מערכת של ארבעה ליזר דיסק ספינינג confocal מיקרוסקופ 17. ההדמיה באופן זה אפשרה לנו ללמוד תהליכים כאלה כמו בהפצת סמי vivo, פרק שלב תלויתגובות emotherapeutic, סוג של מות כימותרפיה תא, והתנהגות תא מיאלואידית 5.
אנו מספקים פרוטוקול להדמית intravital של תגובות תא סרטני לטיפול נגד הסרטן ואינטראקציות גידולי סטרומה במודלי עכבר של סרטן השד. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר ההתנהגויות והמוות של שני תאים סרטניים ורכיבי סטרומה עם מגוון רחב של תוויות ניאון מהונדסות וזריקות במודלים מהונדסים והן השתלה לתקופות של עד 40 שעות בישיבת הדמיה בודדה.
Protocol
Discussion
את התגובות של גידולים לטיפולים מערכתיים in vivo יכולות להיות שונות באופן דרמטי לאלה של תאים סרטניים במבחנה, כmicroenvironment משפיע גם התגובה והישנות 5 החריפות. אחד המכשולים הגדולים ביותר להבהרה במסלולי chemoresistance vivo הוא המורכבות של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים וMicroenvironment. בפרט, משום שגידולים מוצקים פתחו איזון בין הסרטן ותאי סטרומה ביומו של מרכיב אחד, כגון מוות של תאים המתרחש במהלך טיפול נגד הסרטן, עלול לגרום להשפעות דרמטיות על ארגון רקמות.
טכניקת הדמית intravital ספקה כאן מאפשרת להדמיה הישירה של אינטראקציות סרטן התאים stroma בתוך הגידולים של עכברים חיים, מורדמים במהלך טיפול עם תרופות נוגדות סרטן. אנו משתמשים במיקרוסקופ ספינינג confocal דיסק, שבו יש עומק חדירה מוגבלת יחסית (ראה 17 </sup>), אבל הטכניקות הניתוחיות ותיוג שלנו ניתן להשתמש בסוגים אחרים של מיקרוסקופיה. סרטים שנרכשו מניסויים אלה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תהליכים הכוללים שינויים בעוצמת קרינה (למשל עקב חדירה של אוכלוסייה או אינדוקצית כותרת של מוות של תאים), תנועתיות תא, חלוקת ההזרקה (למשל כדי לעקוב אחר דליפה של כלי דם), ושיתוף לוקליזציה של אותות ניאון 5,12,17,20.
באופן שוטף אנחנו עכברי תמונה עבור מעל 6 שעות והדמיה גם בצעה במשך 18 שעות. זה מחייב שמירה על העכברים ברציפות תחת הרדמה לפרקי הזמן הארוכים הללו. בהרדמה ראויה, מעל 90% מבעלי החיים שלנו לשרוד 6 שעות, וכ 80% לשרוד במשך 18 שעות. פרטים על אופן ביצוע הרדמה לטווח ארוך כבר פורסם בעבר 19. מניסיוננו, חמישה גורמים הם קריטיים: הימנעות היפותרמיה, הימנעות התייבשות, שמירה על רמות רוויון חמצן בדם פיסיולוגי, uלשיר גז מוביל humidified לisoflurane, ושמירה על בעלי החיים ברמה הנמוכה ביותר של הרדמה שבה הם לא מראים סימנים של כאב. כדי לשמור על טמפרטורת גוף, אנחנו שומרים עכברים מתחת לשמיכה מחוממת (ב38 ° C). כדי למנוע התייבשות, אנחנו מזריקים כמויות קטנות של ה-IP המלוחה לאורך ההליך כל ההדמיה. כדי לשמור על רמות רוויון חמצן בדם פיסיולוגי, אנחנו מתחילים עם חמצן 21% בגז המוביל (ולא 100% בשימוש נפוץ). זה מאפשר לנו להגדיל את רמות חמצן בשאיפה אם עכבר – שעות לניסוי – מראה ירידה בריווי חמצן בדם. מהניסיון שלנו, להגדיל את רמות החמצן בשאיפה בשלב כזה (למשל כדי 30-40%) כמעט תמיד יתייצב החיה המאפשרת שעות של הדמיה נוספת. הרמה האופטימלית של הרדמה היא עבור רוב העכברים שהושגו עם 1-1.5% isoflurane ותוצאות בשיעורי נשימה של דופק של 400-450/min 60-65/min ו. בניסויי ההדמיה שלנו, אנו משתמשים בעיקר במודל עכבר מהונדסs (MMTV-PyMT וC3 [1]-Tag) שבגידולים הן המולטי, המאפשר הדמיה של נגעים מרובים בשלבים שונים של התקדמות גידול במקביל בx המרובה, עמדות y במהלך הדמיה בודדה. זה מקטין חששות לגבי וריאצית עכבר לעכבר ביחס לניסויים שמטרתם איתור תגובות טיפוליות במה תלויה, ומפחית את מספר בעלי החיים הדרושים להדמיה.
מודל MMTV-PyMT (ודגמים אחרים של סרטן ספונטני) לעבור שלבי histopathological מתקדמים שניתן להכיר במהלך הדמית intravital, למרות ההיערכות פתולוגית של נגעים סרטניים שניתן לעשות במהלך הדמית intravital שונה מ, ופחות מפורטת, יותר מזה של סעיפים היסטולוגית 5,17. בניגוד לכך, מודלי השתלה נוטים לשקף גידולים בשלב המאוחר ביותר, כמו התאים הסרטניים בדרך כלל מבודדים מגידולים מתקדמים. מודלים כאלה הם כך נוחים יותר ללימוד גידולי סטרומהאינטראקציות של גידולים בשלב מאוחר מאשר הבדלים באינטראקציות הללו בין שלבים שונים.
אנחנו מראים דוגמאות כיצד שינויים מבניים גרעיניים תמונה המתרחשים לאחר מוות של תאים הנגרם על ידי טיפול. בהעדר הטיפול אנטי סרטני, אסטרטגית תיוג זה עשויה במקום לשמש לחלוקת תא תמונה באתר, הבהרה, לדוגמה, כיצד התפשטות תאים ותרדמת מושפעת microenvironment. בעתיד, ניאון תיוג של רכיבי המיטוכונדריה יכול לעשות את זה אפשרי לשינויי תמונת המיטוכונדריה המתרחשים במהלך מוות של תאים אפופטוטיים.
בפרוטוקול זה, יש לנו גם הראה דוגמאות כיצד אינטראקציות תמונת סרטן תאי תא חיסון לאחר טיפול, אבל רכיבים microenvironmental אחרים יכולים להיות גם נראים והדמיה. קווי כתב מהונדסים קיימים לרכיבי סטרומה כוללים אלה של fibroblasts (למשל., FSP1-EGFP 17, 21 αSMA-RFP, COL1A1-EG21 FP) או תאים של כלי הדם (למשל Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Intravital ההדמיה מאפשרת הדמיה בזמן האמת של יחסי הגומלין ותהליכים המתרחשים בממשל כימותרפיה הבא vivo. בעזרת הטכנולוגיה זמינה כרגע, יש לנו התקדמות משמעותית בהבנה כיצד תאי מיאלואידית להשפיע תגובה טיפולית, עם זאת, כי גידול microenvironment הוא כל כך מורכב, התקדמות גדולה עדיין תהיה צורך להתחיל להתעמק מכאני לתוך התהליכים העומדים בבסיס התנגדות לתרופת סביבה בתיווך. אחד הפיתוחים החשובים ביותר עדיין נדרשים הוא זיהוי של סמנים טובים יותר לאוכלוסיות תאים ספציפיות. החשיבות של סמנים טובים יותר מודגמת היטב בשניים ממרכיבי התא סטרומה הבולטים של microenvironment גידולי סרטן השד, fibroblasts ותאי מערכת חיסון. השריר יקטין α-Smooth (αSMA) משמש לעתים קרובות כדי לזהותfibroblasts, אבל החלבון בא לידי ביטוי גם על ידי תאי שריר חלק של כלי דם ותאי myoepithelial 24. כך, למרות שעכברי הכתב αSMA-GFP קיימים, קביעת סוג התא המסוים להיות בא במהלך ניסוי הדמית intravital היא מאתגרת. בדומה לכך, סמן ניאון בודד כגון EGFP הביע תחת אמרגן c-FMS יהיה לעתים קרובות לזהות אוכלוסיות רבות של תאים חיסוניים 12,17. לכן, למרות שאחד באופן אידיאלי הייתי רוצה להשתמש בסמן יחיד לזיהוי סוג תא מסוים את המורכבות של הביולוגיה הבסיסית מהוות אתגר מרכזי בשימוש בגישה זו.
פתרון חלקי אחד לבעיה זו הוא שימוש בתוויות בזריקות כדי לבדל אוכלוסיות של תאים המבטאים את אותו כתב ניאון נוסף. לדוגמה, dextrans ניאון הם נלקחו על ידי מקרופאגים וניתן להשתמש בו כדי לתייג את אוכלוסיות macrophage שמתויגים על ידי c-FMS-EGFP והעכברים הטרנסגניים כתב Fsp1-EGFP <sup> 17. נוגדנים מצומדות לבדיקות ניאון יש גם משמשים לזיהוי אוכלוסיות ספציפיות (למשל, את אוכלוסיית Gr1 החיובית של תאי מיאלואידית מתויגים לפי כתב c-FMS-EGFP 17).
בניגוד לעקומות תגובת גידול שנוצרו על ידי קליפר מדידה, המספק מידע מכניסטית קצת על איך או למה להגיב לגידולים הטיפוליים מנוהל, או הסדרה היסטולוגית נגזרים מרקמות שנקטפו בנקודתי זמן שונים הדורשות קבוצות גדולות של בעלי חיים, הטכניקה שלנו מספקת מידע ישיר, כימות על הדינמיקה של מוות של תאים ועל יחסי הגומלין של תאי סטרומה עם תאים סרטניים בקבוצות קטנות. לפיכך, היתרון של שימוש בהליך דיווח כאן הוא שהיא מספקת מידע דינמי על תגובות סמים בהקשר של גידול microenvironment השלם בזמן האמת. מידע כזה יכול להוביל לתובנה חשובות בתהליכים הפנימיים המניעים את תגובה טיפולית 5 </ Sup>.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג' וג' Cappellani צ'יו לתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמכון הלאומי לסרטן (U01 CA141451), סטאר סרטן Consortium, סוזן ג'קומן לריפוי, לונג איילנד יצא יום 2 למאבק בסרטן השד, קואליציית נשי Manhasset נגד סרטן השד לי, ו מלגת קדם דוקטורט מהתכנית לחקר סרטן שד בימוי congressionally, ארה"ב ESNESN היא גם מקבלת מלגות לסלי ג ויליאם רנדולף הרסט קרן המהירה ומבית הספר ווטסון של מדעי ביולוגיה. Haa נתמך על ידי כספים ממועצת המחקר של נורבגיה (160698/V40 ו151882), ורשויות בריאות אזורית דרום מזרח (2007060).
Materials
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½” regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24×50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75×25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½”) | |||
| Laboratory tape (1″) | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1×2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4″ length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4″ length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾” ultra thin needle, 12″ tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H |
Referanslar
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).
- Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).
- DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).
- Kim, J. B., Stein, R., O’Hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer– a review. Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).
- Gilbert, L. A., Hemann, M. T. DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche. Cell. 143, 355-366 (2010).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).
- Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor. J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).
- Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice. J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).
- Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).
- Brown, E., McKee, T., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nat. Med. 9, 796-800 (2003).
- Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).
- Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J. Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).
- Sounni, N. E., Dehne, K., et al. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Fukumura, D., Xavier, R., et al. Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells. Cell. 94, 715-725 (1998).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).
