Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs
Özet
Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung<em> In vivo</em> Und einzelne Zelle Auflösung.
Abstract
Der Tumor Mikroumgebung spielt eine zentrale Rolle in Tumor Initiation, Progression, Metastase, und dem Ansprechen auf Anti-Krebs-Therapien. Dreidimensionale Co-Kultur-Systeme werden häufig verwendet, um Tumor-Stroma-Interaktionen, einschließlich ihrer Rolle in der Medikamentenentwicklung Reaktionen explizieren. Allerdings können viele der Wechselwirkungen, die in vivo im intakten Mikroumgebung auftreten, nicht vollständig in diesen werden in vitro-Einstellungen repliziert. So, hat direkte Visualisierung der dieser Prozesse in real-time geworden ein wichtiges Werkzeug in das Verständnis Tumor-Reaktionen zu Therapien und die Identifizierung der Interaktionen zwischen Krebs Zellen und dem Stroma, die diese Reaktionen beeinflussen können. Sie hier, stellen wir ein Verfahren für die Verwendung von Kreiselscheibenapplikators konfokale Mikroskopie von lebenden, anästhesiert Mäuse, um direkt beobachten der Verteilung des Arzneimittels, Krebs Zell-Reaktionen und Veränderungen in Tumors-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung von systemischen Therapie bei Brustkrebs Modelle. Wir beschreiben Verfahren für die labeling verschiedenen Tumor Komponenten, Behandlung von Tieren für die Beobachtung therapeutische Reaktionen, und die chirurgische Prozedur zum Belichten von Tumor-Geweben für die Bildgebung up bis 40 Stunden. Die Ergebnisse aus dieser-Protokoll erhalten werden, sind time-lapse-filme,, in denen solche Prozessen als Drug Infiltration, Krebszelle Tod und stromalen Zellmigration evaluiert sie mit Bild-Analyse-Software kann werden.
Introduction
Krebszellen und den Stromazellen Bestandteile (beide zellulären und nicht-zellulären), die bei der Aufrechterhaltung eines geeigneten Umfelds für das Tumorwachstum 1 Assist: Solide Tumoren bestehen aus zwei großen Fächern zusammen. Diese Stromatumoren Bestandteile spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung, Progression und Metastasierung von vielen Arten von Krebs, einschließlich derjenigen der Brust 2-5. Die Stromazellen Milieu beeinflusst auch therapeutische Reaktionen 2,4,5. Somit bestimmen, wie Krebszellen zu konventionellen und neuartige Therapien ansprechen im Kontext des intakten Mikroumgebung ist, das Verständnis der Krebsbiologie und Verbesserung der derzeitigen therapeutischen Strategien wichtig. Darüber hinaus definiert, wie Krebszellen-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung der Therapie zu ändern, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Biologie des Tumors Rückfall.
Organotypischen Kokultur Systeme wurden für die Untersuchung Tumor-Stroma-Interaktionen nützlich <sbis> 6, aber es ist offensichtlich, dass die derzeit verfügbaren Methoden nicht erfolgreich rekapitulieren die intakte Tumormikroumgebung in vitro, insbesondere bezüglich Gefäßfunktion und Rekrutierung von Immunzellen. Tatsächlich sind Krebszelle Reaktionen auf Therapien, die in vitro beobachtet werden oft erheblich von denen in vivo, wo der Mikroumgebung intakt 5 beobachtet. So kann in vivo Modelle für das Studium Tumor-Stroma-Interaktionen und deren Auswirkungen auf therapeutische Reaktion besser widerspiegeln klinisch relevanten Mechanismen sieben.
Die primäre Mittel des Studiums Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie in vivo haben durch Messungen der Tumorgröße und histologische Untersuchung von Gewebe aus behandelten Tieren oder Patienten gewonnen wurden. Allerdings haben Fortschritte in der Mikroskopie und Fluoreszenz-Reporter in den vergangenen zwei Jahrzehnten die Visualisierung der inter-und intrazellulären Prozesse aktiviertmit hoher Auflösung in live, narkotisierten Tieren (intravital imaging) 8. Diese Intravitalmikroskopie Technologien haben sich als besonders wertvoll für räumlich und zeitlich sezieren die in vivo Dynamik der Tumor-Stroma-Interaktionen auf zellulärer und sub-zellulärer Auflösung 8,9.
Prozesse, die von intravitalen Imaging wurden entwirrt umfassen Anti-Tumor-T-Zellen-Cytotoxizität 10,11, Interaktionen zwischen T-Zellen und myeloiden Zellen 12, die Dynamik der Veränderungen in Kollagenzusammensetzung und Organisation nach therapeutischer Behandlung 13, Makrophagen-abhängigen Krebszelle Intravasation und Metastasierung 14 und Gefäßpermeabilität 15.
Es gibt drei wesentliche Voraussetzungen für intravital Bildgebung. Dazu gehören eine angemessene Vorbereitung und Belichtung von Geweben für die Bildgebung, Fluoreszenzmarkierung der Gewebe-Komponenten von Interesse, und eine gepaarte Mikroskopie-Kamera system Lage des Erwerbs Bilder 16. Die häufigsten verwendeten Strategien, um diese Anforderungen zu erfüllen sind: 1) heterotope Zubereitungen (zB Impfung am Ohr oder Auge orbital), permanent Bildgebung Fenster oder exteriorisierten Zubereitungen (zB dorsalen Hautlappen); 2) Transgene fluoreszierenden Reporter und.. fluoreszierenden Injektabilia zu etikettieren Gewebekomponenten und 3) Multiphotonen oder konfokalen Mikroskopie-Systeme mit Photovervielfacherröhren oder Charge-Coupled Device (CCD)-Kameras bzw. 9 gepaart. Wir verwenden eine chirurgisch präparierten Hautlappen Modell, um die Leistengegend Brustdrüse für die Bildgebung in narkotisierten Tieren, die Transgene kodieren fluoreszierenden Reporter auszudrücken aussetzen. Bilder werden über einen Zeitraum von 12 bis 40 Stunden unter Verwendung einer intensivierten CCD (ICCD)-Kamera mit einem Vier-Laser Schleuderscheibe konfokalen Mikroskopsystem 17 gepaarten erhalten. Imaging in dieser Weise hat uns erlaubt, solche Prozesse in vivo Verteilung von Medikamenten, Bühne-abhängige ch studierenemotherapeutic Reaktionen, der Art der Chemotherapie-induzierten Zelltod und myeloide Zellverhalten 5.
Wir stellen ein Protokoll für die intravitalen Bildgebung Krebszelle Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie und Tumor-Stroma-Interaktionen in Mausmodellen von Brustkrebs. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Einstellungen und den Tod beider Krebszellen und Stromazellen Komponenten mit einer Vielzahl von transgenen und injizierbare Fluoreszenzmarkierungen in beiden transgenen und Transplantationsmodellen für Zeiträume von bis zu 40 Stunden in einem einzigen Bildgebungssitzung verfolgen.
Protocol
Discussion
Die Antworten von Tumoren auf systemische Therapien in vivo kann drastisch unterscheiden, die von Krebszellen in vitro, wie der Mikroumgebung sowohl die akute Reaktion und Rückfall 5 beeinflusst. Eines der größten Hindernisse für die Explikation in vivo Chemoresistenz Wege ist die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung. Insbesondere weil festen Tumoren ein Gleichgewicht zwischen Krebs und Stromazellen, Störungen der einen Komponente, z. B. dem Zelltod, die während Antikrebsbehandlung auftritt entwickelt werden, können in der drastischen Auswirkungen auf Gewebeorganisation führen.
Die intravitalen Bildgebungstechnik hier bereitgestellten ermöglicht die direkte Visualisierung Krebszelle-Stroma Wechselwirkungen innerhalb der Tumoren von lebenden, narkotisierten Mäusen während der Behandlung mit Anti-Krebs-Arzneimittel. Wir verwenden Schleuderscheibe konfokale Mikroskopie, die eine relative begrenzte Eindringtiefe hat (siehe 17 </sup>), aber unsere chirurgischen und Markierungstechniken kann mit anderen Arten von Mikroskopie verwendet werden. Filme aus diesen Versuchen erfasst kann verwendet werden, um Prozesse, die Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (zB durch Infiltration eines markierten Population oder Induktion von Zelltod), Zellmotilität, Verteilung von injizierbaren (zB um Extravasation zu verfolgen), und Co-beinhalten verfolgen Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen 5,12,17,20.
Wir routinemäßig Bild Mäuse für über 6 Stunden und auch durchgeführt Bildgebung für über 18 Stunden. Dies erfordert die Aufrechterhaltung der Mäuse kontinuierlich unter Narkose für diese lange Zeiträume. Mit der richtigen Anästhesie, überleben mehr als 90% unserer Tiere 6 Stunden und etwa 80% mehr als 18 Stunden überleben. Einzelheiten zur langfristigen Betäubung wurden bisher 19 veröffentlicht. In unserer Erfahrung sind fünf Faktoren entscheidend: die Vermeidung Hypothermie vermeiden Dehydrierung, die Aufrechterhaltung physiologischer Sauerstoffsättigung des Blutes Ebenen, usingen befeuchtet Trägergas für Isofluran und Haltung der Tiere auf der untersten Ebene der Anästhesie, an dem sie nicht zeigen Anzeichen von Schmerzen. Auf Körpertemperatur zu halten, sollten wir Mäuse unter einer Heizdecke (bei 38 ° C). Um Austrocknung zu vermeiden, spritzen wir kleine Mengen von Kochsalzlösung ip während der gesamten bildgebenden Verfahren. Um physiologische Blutsauerstoffsättigung Niveau zu halten, beginnen wir mit 21% Sauerstoff im Trägergas (anstelle der üblichen 100%). Dies ermöglicht uns, eingeatmete Sauerstoff Ebenen, wenn eine Maus zu erhöhen – Stunden in einem Experiment – zeigt eine Abnahme in die Sauerstoffsättigung des Blutes. In unserer Erfahrung, die Erhöhung der eingeatmeten Sauerstoff zu diesem Zeitpunkt (z. B. 30-40%) fast immer stabilisieren wird das Tier unter Berücksichtigung Stunden zusätzliche Bildgebung. Die optimale Höhe der Anästhesie ist für die meisten Mäuse mit 1-1,5% Isofluran und Ergebnisse im Atem Raten 60-65/min und Impulsraten von 400-450/min erreicht. In unserer Imaging-Experimente, wir verwenden in erster Linie transgenen Mausmodells (MMTV-PYMT und C3 [1]-Tag), in der Tumore sind multifokalen, so dass zum Abbilden mehrerer Läsionen in verschiedenen Stadien der Tumorprogression, die parallel in mehreren x, y-Positionen während einer einzigen Bildgebungssitzung. Dies verringert Bedenken hinsichtlich Maus zu Maus Variation bezüglich Experimente bei Identifizieren Stufe-abhängige therapeutische Reaktionen abzielen, und reduziert die Anzahl von Tieren zum Abbilden erforderlich.
Die MMTV-PYMT Modell (und andere spontane Krebsentstehung Modelle) gehen durch progressive histopathologischen Stadien, die während intravital Bildgebung erkannt werden kann, obwohl die pathologische Staging des Tumors Läsionen, die während intravital Bildgebung durchgeführt werden kann, ist anders und weniger detailliert, als die histologischen Schnitten 5,17. Im Gegensatz dazu tendieren Transplantationsmodellen bis späten Stadium Tumoren am besten widerspiegeln, wie die Krebszellen meist aus fortgeschrittenen Tumoren isoliert werden. Solche Modelle eignen sie sich zum Studium Tumor-StromaWechselwirkungen der späten Stadium Tumoren als Unterschiede in diesen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Stadien.
Wir zeigen Beispiele, wie man Bild nuklearen strukturellen Veränderungen, die nach der Zelltod durch Therapie induziert auftreten. In Abwesenheit von Anti-Krebs-Behandlung, das Markierungsstrategie vielmehr zu einer Bild Zellteilung in situ verwendet werden, aufzuklären, zum Beispiel, wie Zellproliferation und Keimruhe durch die Mikroumgebung beeinflusst. In der Zukunft kann Fluoreszenzmarkierung mitochondrialen Komponenten ermöglichen, um Bild mitochondrialen Veränderungen, die während Apoptose auftreten.
Bei diesem Protokoll, haben wir auch Beispiele zum Bild Krebszelle-Immunzelle Wechselwirkungen nach der Therapie, aber andere Mikroumgebungsbedingungen Komponenten können auch visualisiert und bebilderten gezeigt. Bestehende transgenen Reporter Linien für stromalen Komponenten umfassen solche für Fibroblasten (zB., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) oder Zellen des Gefäßsystems (zB Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).
Intravital Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Interaktionen und Prozesse, die in vivo nach Verabreichung der Chemotherapie auftreten. Mit der Technologie, die derzeit verfügbar sind, haben wir große Fortschritte im Verständnis, wie myeloischen Zellen beeinflussen therapeutische Reaktion gemacht, aber weil der Tumor-Mikroumgebung ist so komplex, große Fortschritte sind erforderlich, um beginnen zu mechanistisch tief in die zugrunde liegenden Prozesse umwelt-vermittelten Resistenz. Einer der wichtigsten Fortschritte noch erforderlich ist die Identifizierung besser Marker für spezifische Zellpopulationen. Die Bedeutung einer besseren Marker ist mit zwei der herausragenden Stromazellen Komponenten des Brusttumor Mikroumgebung, Fibroblasten und Immunzellen veranschaulicht. α-smooth muscle actin (αSMA) wird häufig verwendet, um zu identifizierenFibroblasten, aber das Protein auch von vaskulären glatten Muskelzellen und Myoepithelzellen 24 exprimiert. So, obwohl αSMA-GFP-Reporter Mäusen vorhanden sind, die Bestimmung der spezifischen Zelltyp ist folgende während einer intravital Imaging-Experiment ist eine Herausforderung. Ebenso wird ein einzelner fluoreszierender Marker, wie zB EGFP unter der c-fms-Promotors exprimiert kennzeichnen häufig mehrere Subpopulationen von Immunzellen 12,17. Obwohl also ein idealer möchten eine einzelne Markierung zu verwenden, um einen bestimmten Zelltyp zu identifizieren die Komplexität der zugrunde liegenden Biologie eine große Herausforderung bei der Verwendung dieses Ansatzes.
Eine Teillösung für dieses Problem ist die injizierbare Etiketten verwenden, um weiter zu differenzieren Subpopulationen von Zellen, die den gleichen fluoreszierenden Reporter. Beispielsweise werden fluoreszierende Dextrane von Makrophagen aufgenommen und können die Makrophagen Subpopulationen, die durch die c-fms-EGFP und FSP1-EGFP transgenen Reportermäuse markiert sind zu markieren <sup> 17. Antikörper, konjugiert an fluoreszierenden Sonden wurden ebenfalls verwendet, um spezifische Subpopulationen (zB die Gr1-positiven Population von myeloiden Zellen durch die c-fms-EGFP-Reporter 17 beschriftet) identifizieren.
Anders als Tumor-Antwort-Kurven durch Dickenmessung, die wenig mechanistische Informationen oder warum Tumore reagieren auf das verabreichte therapeutische oder histologische Reihe von Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten, die große Kohorten Tiere benötigen geerntet wurden bereitzustellen erzeugt, stellt unsere Technik direkte, quantifizierbare Daten auf der Dynamik des Zelltods und auf die Wechselwirkungen von Stromazellen mit Krebszellen in kleinen Kohorten. Damit ist der Vorteil der Verwendung des Verfahrens hier berichtet, dass sie dynamische Informationen Medikament Reaktionen liefert im Kontext eines intakten Tumormikroumgebung in Echtzeit. Solche Informationen können wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Prozesse, die therapeutische Reaktionen fahren 5 führen </ Sup>.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken J. Cappellani und J. Qiu für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem National Cancer Institute (U01 CA141451), der Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for the Cure, Long Island 2 Day Walk to Breast Cancer, Manhasset Damen Coalition Against Breast Cancer gegen mich zu kämpfen, und einem unterstützten Pre-Doc-Stipendium der vom Kongress Regie Breast Cancer Research Program, ist USA ESNESN auch der Empfänger der Leslie C. Schnelle und William Randolph Hearst Foundation Fellowships aus dem Watson School of Biological Sciences. HAA wurde durch Mittel aus dem Research Council of Norway (160698/V40 und 151.882) und Southeastern Regional Health Authorities (2.007.060) unterstützt.
Materials
| Reagent | |||
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
| 1 x PBS | Made in-house | ||
| 2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
| Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
| Nitrogen | |||
| Oxygen | |||
| Equipment | |||
| 18G x 1½” regular bevel needle | BD | 305196 | |
| μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
| Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
| Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24×50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
| Glass microscope slides | Corning | 2948-75×25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Heated blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
| Laboratory tape ( ½”) | |||
| Laboratory tape (1″) | |||
| Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1×2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4″ length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4″ length |
| Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
| MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
| Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
| Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
| Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾” ultra thin needle, 12″ tubing |
| Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H |
Referanslar
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