Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Elizabeth S. Nakasone; Hanne A. Askautrud; Mikala Egeblad

doi:10.3791/50088

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Tıp

Imágenes en directo de las respuestas de drogas en el microambiente tumoral en modelos de ratón de cáncer de mama

Published: March 24, 2013

doi:

10.3791/50088

Elizabeth S. Nakasone^1,2, Hanne A. Askautrud^2,3, Mikala Egeblad²

¹Watson School of Biological Sciences, ²Cold Spring Harbor Laboratory, ³Departments of Medical Genetics,University of Oslo and Oslo University Hospital

Özet

Se describe un método para la formación de imágenes respuesta a tratamiento contra el cáncer In vivo Y en resolución única célula.

Abstract

El microambiente tumoral juega un papel fundamental en la iniciación del tumor, progresión, metástasis, y la respuesta a terapias contra el cáncer. Tridimensionales de co-cultivo sistemas se utilizan con frecuencia para explicar las interacciones tumor-estroma, incluyendo su papel en las respuestas de drogas. Sin embargo, muchas de las interacciones que se producen in vivo en el microambiente intacto no puede ser completamente replicado en estos ajustes en in vitro. Por lo tanto, la visualización directa de estos procesos en tiempo real se ha convertido en una herramienta importante en la comprensión de las respuestas a las terapias tumorales y la identificación de las interacciones entre las células cancerosas y el estroma que puede influir en estas respuestas. Aquí se proporciona un método para el uso de la microscopía confocal de disco giratorio de ratones vivos, anestesiados para observar directamente de distribución de fármacos, las respuestas de células cancerosas y los cambios en las interacciones tumor-estroma después de la administración de la terapia sistémica en modelos de cáncer de mama. Se describen procedimientos para labeling componentes diferentes de tumores, el tratamiento de los animales para la observación de las respuestas terapéuticas y el procedimiento quirúrgico para exponer los tejidos tumorales para imágenes de hasta 40 horas. Los resultados obtenidos de este protocolo son películas a intervalos, en los que los procesos tales como infiltración de droga, la muerte celular del cáncer y la migración de células del estroma pueden ser evaluados utilizando software de análisis de imagen.

Introduction

Los tumores sólidos están compuestos de dos compartimentos principales: las células cancerosas y los componentes del estroma (tanto celulares y no celulares-) que ayudan en el mantenimiento de un ambiente adecuado para el crecimiento del tumor ^1. Estos componentes del estroma desempeñan papeles críticos en el desarrollo, progresión y metástasis de muchos tipos de cánceres, incluyendo los de la mama ^2-5. El medio estromal también influye en las respuestas terapéuticas ^2,4,5. Por lo tanto, la determinación de cómo las células cancerosas responden a las terapias convencionales y nuevas en el contexto de la microambiente intacta es importante para avanzar en nuestro entendimiento de la biología del cáncer y la mejora de estrategias terapéuticas actuales. Por otra parte, la definición de cómo el cáncer de células del estroma interacciones cambiar después de la administración de la terapia es fundamental para la comprensión de la biología de la recidiva tumoral.

Organotípicos co-cultivo de los sistemas han sido útiles para el estudio de las interacciones tumor-estroma <shasta> 6, pero es evidente que los métodos actualmente disponibles no con éxito puede recapitular el microambiente del tumor intacto in vitro, en particular con respecto a la función vascular y reclutamiento de células inmunes. De hecho, las respuestas celulares de cáncer a las terapias que se observan in vitro a menudo son significativamente diferentes de los observados in vivo, donde el microambiente está intacta ^5. Así, tr modelos in vivo para el estudio de tumores del estroma interacciones y su impacto en la respuesta terapéutica puede reflejar mejor los mecanismos de relevancia clínica ^7.

Los medios principales de estudio de las respuestas a la terapia contra el cáncer in vivo han sido a través de mediciones del tamaño del tumor y la evaluación histológica de tejidos derivados de animales tratados o pacientes. Sin embargo, los avances en microscopía fluorescente y periodistas en las últimas dos décadas han permitido la visualización de los procesos inter e intracelularAlta resolución de animales vivos, anestesiados (intravital de imágenes) ^8. Estas tecnologías de microscopía intravital han demostrado ser especialmente valioso para espacial y temporalmente tr la disección de la dinámica in vivo de tumor-estroma interacciones en resolución celular y subcelular ^8,9.

Los procesos que se han descifrado por formación de imágenes intravital incluyen anti-tumor citotoxicidad de las células T ^10,11, interacciones entre las células T y las células mieloides ^12, la dinámica de los cambios en la composición y la organización de colágeno después del tratamiento terapéutico ^13, macrófagos dependiente de la intravasación de células cancerosas y metástasis ^14, y la permeabilidad vascular ^15.

Existen tres requerimientos principales para la formación de imágenes intravital. Estos incluyen la adecuada preparación y exposición de los tejidos de formación de imágenes, el marcaje fluorescente de los componentes del tejido de interés, y una s-cámara emparejado microscopíaistema capaz de adquirir imágenes ^16. Las estrategias más comunes que se utilizan para hacer frente a estos requisitos incluyen: 1) los preparativos heterotópicas (por ejemplo, la inoculación de la oreja o el ojo orbital), permanente de imágenes de Windows, o preparaciones exteriorizadas (por ejemplo, la aleta dorsal piel), 2) los transgénicos fluorescentes y reporteros.. inyectables fluorescentes para etiquetar los componentes del tejido, y 3) los sistemas de microscopía confocal o multifotón emparejado con tubos fotomultiplicadores o dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) cámaras, respectivamente ^9. Se utilizó un modelo de colgajo de piel quirúrgicamente preparado para exponer la glándula mamaria inguinal para imágenes en los animales anestesiados que expresan transgenes que codifican los reporteros fluorescentes. Las imágenes se obtuvieron durante un período de 12 a 40 horas, usando un CCD intensificada (ICCD) de la cámara se combina con un sistema láser de cuatro hilado disco microscopio confocal ^17. Imágenes de esta manera nos ha permitido estudiar procesos como la distribución de drogas en vivo, dependiente de la etapa chrespuestas emotherapeutic, tipo de muerte celular inducida por la quimioterapia, y el comportamiento celular mieloide ^5.

Proporcionamos un protocolo para la formación de imágenes intravital de respuestas celulares de cáncer a la terapia anti-cáncer y tumor-estroma interacciones en modelos de ratón de cáncer de mama. Este protocolo se puede utilizar para realizar un seguimiento de los comportamientos y la muerte de las células cancerosas y las componentes del estroma con una amplia variedad de marcadores fluorescentes transgénicos e inyectables, tanto en modelos transgénicos y trasplante durante periodos de hasta 40 horas en una sola sesión de imágenes.

Protocol

Todos los procedimientos descritos deben ser realizados de acuerdo con las directrices y normas para el uso de animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa por el Cuidado de Animales institucional local y el empleo. 1. La generación de los tumores de mama de ratón de la Imagen (transgénicos o ortotópico) Generar tumores mamarios para formación de imágenes utilizando modelos de ratón genéticamente modificados (por ejemplo, de mama de ratón repetición terminal larga del virus del tumor [MMTV]-polioma medio T antígeno [PYMT] o la rata C3 (1) promotor impulsado antígeno T grande (Tag) de SV40 [C3 ( 1)-tag] modelos) o modelos de trasplante ortotópico (singénico, alogénico o xenogénico). Etiqueta de las células cancerosas por el cruce de los modelos de ingeniería genética con líneas indicadoras transgénicos (por ejemplo ACTB-ECFP) o utilice la manipulación ex vivo de las células cancerosas primarias o líneas celulares (por ejemplo, transducción) seguida de trasplante. Para un protocolo de muestra para trasplante ortotópico, see 18. 2. Visualización de componentes del microentorno tumoral o componentes subcelulares Visualización de componentes tumorales utilizando etiquetas transgénicos. Cruce transgénicos modelos de tumores en ratones transgénicos (por ejemplo reportero c-fms-EGFP de células mieloides o ACTB-H2B-EGFP de núcleos) o utilizar ratones, como los receptores de los tejidos trasplantados, con etiquetas. Esto permite la visualización de las interacciones celulares de cáncer de células del estroma en respuesta a la terapia o cambios nucleares asociados con la muerte celular, respectivamente. Visualizando el microambiente de usar los inyectables. Una amplia variedad de agentes (por ejemplo, anticuerpos marcados con fluorescencia o colorantes químicos) puede ser utilizada para etiquetar diversos componentes del tumor. Dependiendo de la vida media del colorante y la respuesta se está interesado en el seguimiento, el inyectable se puede administrar antes del inicio de la formación de imágenes o durante la sesión de formación de imágenes por vía intravenosa (iv.) O intraperitoneally (ip., Figura 1). 3. Microscopios y software de imágenes Microscopio. Una variedad de sistemas de microscopio y el software se puede utilizar para la formación de imágenes de ratones vivos. Los sistemas más comúnmente utilizados son los microscopios confocales o multifotónica. Usamos un micro-lensed microscopio confocal disco giratorio (Tecnologías Solamere, Salt Lake City, UT) con una cámara ICCD (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA). Proyección de imagen de software. Usamos el μManager software de código abierto (Vale Lab de la Universidad de California, San Francisco [UCSF]). Análisis de la imagen. Usamos Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), y ImageJ (Instituto Nacional de Salud [NIH]) para el análisis de imagen. 4. (Pre)-tratamiento de los animales de la Imagen Inguinales tumores mamarios son óptimas para la formación de imágenes utilizando el protocolo cuando el diámetro más largo mide aproximadamente 8 mm o menos por el calibrador de mediciónement. Para los animales de formación de imágenes tratadas con un inhibidor de molécula pequeña, anticuerpo terapéutico o fármaco quimioterapéutico, iniciar el tratamiento antes o durante la formación de imágenes como se requiere para el experimento. Por ejemplo, las imágenes de la extravasación y distribución de drogas requiere la administración después de la impresión se ha iniciado (Películas 1 y 2), mientras que las imágenes de la muerte celular inducida por la doxorrubicina, un medicamento quimioterapéutico es mejor capturada por imágenes de partida 24 hr o más tarde después del tratamiento farmacológico (3 Películas y 4). 5. Preparación de solución salina para mantener la osmolaridad hidratación y la sangre del animal durante la exploración Dibujar aproximadamente 1 ml de 1x PBS en una jeringa de 1 ml. El yoduro de propidio (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, diluidas 1:15) se puede añadir a esta solución que se administra periódicamente (ip.) Durante la sesión de formación de imágenes. Esto permitirá la obtención de imágenes de los núcleos de las células muertas o moribundas que tienen membranas permeables celulares. PI tiene una muy corta half-vida en la vasculatura y por lo tanto debe administrarse de nuevo a lo largo de la sesión de formación de imágenes. Asociar un conjunto de infusión con alas (23 gauge, ¾ pulgada aguja, tubo de 12 pulgadas) a esta jeringa y empuje la solución a través de la tubería hasta que una gota de solución salina sale de la punta de la aguja en el extremo de la tubería. Retire la jeringa del equipo de infusión, y llenarlo con la solución salina adecuada. Vuelva a conectar la jeringa al equipo de infusión, con cuidado de no introducir burbujas en la línea. 6. Preparación del sistema de anestesia isoflurano Añadir agua hasta el nebulizador y el tornillo en su lugar. Esto humidificar los gases suministrados a los animales, prevención de la irritación de los pulmones y prolongar la supervivencia de los animales bajo anestesia de larga duración. Llene el tanque de isoflurano a la línea superior. PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico potente que también puede afectar el investigador. Sistemas adecuados de vacío debe be en el lugar para asegurar que los gases en exceso se eliminan de la zona. Encienda el tanque de oxígeno y los tanques de nitrógeno y ajustar el flujo. El nitrógeno debe estar en alrededor de 1,0 L / min, mientras que el oxígeno debe estar en alrededor de 0,2 L / min (~ 21%). Encienda el vacío (in-house). El vacío debe ser de aproximadamente 1,2 L / min. Confirme que la línea de la anestesia para la cámara de inducción está abierto, y las líneas a la zona de la cirugía y el microscopio están cerrados. Confirmar que la bolsa de respiración látex unido al sistema de anestesia se infla. Si la bolsa no se infla, cámbielo. Ver el diafragma de caucho en cada uno de los conos de ojiva entrega de anestesia a la platina del microscopio y la plataforma quirúrgica. Si la goma está empezando a reducirse, cámbielo. 7. Elaboración de instrumentos quirúrgicos y quirúrgicos Plataforma Encienda un esterilizador de cuentas caliente y llevarlo a> 200 ° C. Lavar las herramientas quirúrgicas con agua y jabón(Un par de fórceps [preferiblemente con dientes] y tijeras para cortar a través de la piel del animal, un par de fórceps [preferiblemente serrado] y tijeras para la exposición adicional del tumor). Esterilice los instrumentos quirúrgicos durante al menos 30 segundos utilizando el caliente esterilizador de cuentas (como alternativa, los instrumentos quirúrgicos se pueden esterilizar por adelantado). Deje que los instrumentos quirúrgicos refrescarse mientras se asegura de evitar la contaminación de las herramientas esterilizadas. Recoger la tapa a un enfriador de envío de espuma de poliestireno. Esta será su plataforma quirúrgica. Coloque una pieza de un laboratorio de remojo en la parte superior de la tapa de espuma de poliestireno (suficiente para cubrirlo). Coloque un cono de la nariz con una línea al sistema de anestesia para el remojo de laboratorio con cinta de laboratorio (1 "cinta funciona mejor aquí). Inserte un 18 G x 1 ½" aguja a través de la cinta en la tapa de espuma de poliestireno en ambos lados del cono de nariz para mantener el cono de nariz asegurado en su lugar. Ponga a un lado betadine, gasas estériles, dos toallitas 70% isopropanol, un microscopiodiapositivas, Krazy Glue, y 4 trozos de cinta de laboratorio (½ "de ancho). 8. Preparación de Microscopio Encienda el microscopio, la cámara y el ordenador con el microscopio. Encienda la manta de calefacción. Si un microscopio invertido se va a utilizar, un inserto de fase medida debe ser diseñado con puertos de formación de imágenes correspondientes a la ubicación de las glándulas mamarias inguinales. Limpie la etapa insertar bien con jabón y agua y secar. Use cinta de laboratorio (½ "funciona mejor) para asegurar cubierta de vidrio (# 1.5 espesor) sobre los puertos de formación de imágenes y limpiar toda la superficie con isopropanol 70%. Cubrir la etapa con una gasa estéril para proteger contra la contaminación. Coloque el inserto etapa en la etapa y deje que se seque al aire. Tear 4 a 6 piezas de cinta de laboratorio (1 "ancho), aproximadamente 6 pulgadas de longitud y la fijación a un lado del microscopio. Estos trozos de cinta se utiliza para colocar el cono de nariz entrega de anestesia al animal de unad fijarlo en su lugar. Tear dos pedazos de cinta (más de ½ pulgada de ancho) que son alrededor de una pulgada de largo. Estos se utilizan para mantener la aguja de mariposa entrega de PBS para el ratón y el portaobjetos de microscopio usado para exponer el tumor en su lugar. 9. La exposición de la glándula mamaria inguinal de la Imagen Anestesiar al animal en una cámara de inducción utilizando 4% de isoflurano con 21% de oxígeno y el resto nitrógeno (velocidad de flujo a aproximadamente 1,0 L / min) como gas portador. Esto debe tomar 2-4 min. Transferir el ratón a la plataforma quirúrgica, una vez que está respirando profunda y lentamente, con la superficie ventral hacia arriba. Abra la línea de anestesia a la plataforma quirúrgica y cierre de la línea de anestesia a la cámara de inducción, en este orden para evitar una presión demasiado alta en el sistema de anestesia. Reducir la concentración de isoflurano del 4% al 2,5% en este momento. Comprobar la retirada pedal reflejo para confirmar que el animal es suficientemente anesthetized para el procedimiento quirúrgico mediante la realización de un sujetador almohadilla de la pata. El animal es anestesiado adecuadamente si no reacciona (por ejemplo, contracción o enrollamiento de la cola) a la almohadilla de la pata pellizco. Si el animal no reacciona a la almohadilla de la pata pellizco, aumentar la concentración de isoflurano. Asegure las extremidades del ratón a la plataforma con cinta quirúrgica laboratorio (½ "cinta funciona mejor para esto). (Opcional) Una vez que el animal está asegurada a la plataforma quirúrgica, el pelo puede ser eliminado de la superficie ventral utilizando una máquina de afeitar electrónico. Si la eliminación química del cabello se prefiere, esta se debe realizar 24-48 horas antes de la cirugía. Eliminar el vello antes de la cirugía ayuda a evitar la contaminación del sitio de formación de imágenes, como pelos sueltos pueden inducir respuestas inmunes fuertes y agudos. Desinfectar la superficie ventral del animal con toallitas 70% de isopropanol y betadine. Usando el primer par de tijeras y pinzas estériles (con dientes), hacer una incisión subcutánea línea media ventralque va desde ~ 3 mm por encima de la uretra a la apófisis xifoides. Tenga cuidado de no perforar o cortar a través del peritoneo. Usando el segundo par de tijeras y pinzas estériles (dentada), desenganche con cuidado de la piel, con la glándula mamaria inguinal adjunta, de la cavidad peritoneal. Tomar un portaobjetos de vidrio y colocarlo contra el colgajo de piel generada en el paso anterior. Colocar el portaobjetos de tal manera que la mayor parte del tumor se sentará plana una vez que el ratón se coloca en el escenario, y que no interfiera con la movilidad de las extremidades traseras. Una vez que el portaobjetos de microscopio se ha colocado adecuadamente, fije la corredera a la superficie externa de la piel usando superglue (p. ej., Krazy Glue). 10. Colocar el ratón en el escenario Retire la cinta de laboratorio asegurar las extremidades del animal a la plataforma quirúrgica. Abra la línea de la anestesia a la platina del microscopio y cerrar la anestesiasia línea a la plataforma quirúrgica, en este orden. Transferir rápidamente el animal a la platina del microscopio. Una vez que el animal ha sido transferido, la posición y asegurar la línea anestesia y el cono de nariz correctamente (por ejemplo, usando cinta de laboratorio) para asegurar que el ratón permanece anestesiado y está en una posición cómoda. Exponer el tumor de manera que se coloca en la parte superior y en el centro de uno de los puertos de vidrio cubiertas de la cubierta de formación de imágenes en la platina del microscopio. Con los oculares, compruebe que el tumor está en posición correcta, y suavemente con cinta adhesiva el portaobjetos de microscopio. La corredera se debe asegurar términos generales, para el flujo de sangre al tejido no esté obstruido. Encintado por el portaobjetos de microscopio ayuda a minimizar los artefactos de imagen introducidos por respiración del animal. Insertar la línea permanente intraperitoneal con infusión alado conjunto unido a una jeringa 1-ml que contiene 1x PBS estéril o solución salina (que contiene opcionalmente un colorante tal como PI) preparado bajo # 5. Injejar el animal con 100 l cuando el IP. línea se inserta. Desde este punto de tiempo hasta el final de la sesión de formación de imágenes, inyectar al animal con 50 l de solución salina a intervalos de 1 hora (o 25 l de solución salina con PI cada min 30). Para monitorear los signos vitales del animal, conecte una sonda de oxímetro (por ejemplo, sistema MouseOx por Starr Life Sciences, Inc.) 19. Cubra el ratón con una manta de calefacción para evitar la hipotermia. 11. Adquisición de Imágenes El software de código abierto μManager (Vale Lab, UCSF) se utiliza para adquirir imágenes con lapso de tiempo. Los datos en bruto se compila en Imaris (Bitplane) de software, y se puede marcar manualmente por observadores independientes, o analizar en cualquiera de software de análisis de imágenes Imaris o de otro tipo (por ejemplo Volocity [PerkinElmer] o ImageJ [NIH]). 12. Eutanasia Al final de la sesión de imagen (1-40 hr, dependiendo del tipo de proceso que se analiza), el animal es sacrificado. La concentración de isofluorano se aumenta a 4%. El animal se observa hasta 30 segundos después de que se apodera de la respiración y luego eliminado de la etapa. La dislocación cervical se realiza para garantizar que el animal ha sido sacrificado. 13. Los resultados representativos Intravital de imágenes utilizando este método permite la visualización directa de diversos procesos, incluyendo la administración de fármacos a los tumores, la extravasación y la distribución de la droga una vez que alcanza el tumor, la muerte celular después del tratamiento terapéutico, y tumor-estroma interacciones en respuesta a la muerte celular 5. Para observar la llegada de un medicamento para el tumor y su distribución después de la extravasación en los tejidos tumorales, el animal se inyecta mientras que las imágenes están siendo adquiridos. Aunque varias clases de chemotherapeutics son débilmente fluorescentes (como la doxorrubicina), muchos no lo son. Fluorescentemente dextranos conjugados pueden ser utilizados como marcadores sustitutos de la administración del fármaco y la difusión en los tejidos. Figura 2 y la película 1 muestran la llegada de un isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado 2 MD dextrano (Invitrogen, 1 mg / ml de 1xPBS) inyectados iv. en un tumor de un MMTV-PYMT; ratón ACTB-ECFP. Tras la llegada del fármaco en el tumor, la extravasación y la difusión a través de los tejidos se pueden obtener imágenes para determinar tanto la vida media intravascular de un fármaco y de distribución de drogas 5. Película 2 muestra la extravasación y la distribución de Alexa Fluor-647-conjugado de dextrano 10 kD (Invitrogen, 1 mg / ml en 1 x PBS) inyectados iv. en un C3 (1)-Tag, ACTB-ECFP, c-fms-EGFP ratón durante la exploración. Después de la compilación de películas a intervalos en Imaris (Bitplane), distribución intravascular vida media y la droga se cuantifica. Para medir la vida media intravascular, La intensidad media de fluorescencia en los vasos sanguíneos del tumor en cada punto de tiempo se calcula y se representó frente al tiempo. Distribución de drogas se cuantifica como un porcentaje de área por área total del tumor que es positivo para el medicamento. Además del seguimiento de la cinética de liberación de fármacos a los tumores, con frecuencia es importante determinar cómo los tumores responden a la terapia. Como terapias contra el cáncer se espera que inducen la muerte celular, yoduro de propidio (PI) o tinción estructurales cambios nucleares se pueden utilizar como un marcador de la inducida por el fármaco de la muerte celular 5. La Figura 3 muestra la respuesta del tumor a la doxorrubicina citotóxico quimioterapéutico en un MMTV -PYMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP ratón. En este triple transgénicos MMTV-PYMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal, ECFP etiquetas de las células del cáncer de mama (azul), y las etiquetas EGFP células mieloides (verde). El animal fotografiado durante esta sesión se administró doxorrubicina 18 horas antes de exponer comenzó PI y se entregó a lo largo de t ipél sesión de imágenes como se describe anteriormente. Las células cancerosas (ACTB-ECFP etiquetado) aparecen como azul, y las células muertas o moribundas aparecen como rojo (tinción con PI). La serie de tiempo presentado aquí demuestra la inducción de la doxorubicina dependiente de la muerte celular en el tiempo. Para cuantificar la inducción de la muerte celular en los tumores, el mismo tipo de análisis utilizado para determinar la distribución de medicamentos se utiliza, en donde la salida es cuantitativa por ciento de área por área total del tumor que es positivo para el PI. Formación de imágenes a gran aumento puede proporcionar información sobre el tipo de muerte celular que las células de cáncer se sometan 5. Película 3 muestra los resultados de un experimento de formación de imágenes para seguir los cambios nucleares típicas de la muerte celular apoptótica en respuesta a la terapia sistémica con doxorrubicina. Para visualizar los núcleos, el animal fotografiado durante esta sesión alberga el reportero ACTB-H2B-EGFP en lugar del reportero c-fms-EGFP, así que los núcleos de las células cancerosas están etiquetados en verde. Esta MMTV-PYMT; ACTB-ECFP, animal ACTB-H2B-EGFP fue administered doxorrubicina (8 mg / kg en 1 x PBS) ip 24 h antes del inicio de la película, y recibieron inyecciones por hora de 1 x PBS que contienen PI (Invitrogen, 1 mg / ml de solución diluida 1:15). Los cambios estructurales en los núcleos de las células de cáncer se puede observar en una célula apoptótica junto a células que han sufrido necrosis (PI-positivas las células que muestran cambios mínimos en la morfología nuclear). Los núcleos de las células apoptóticas eventualmente se convierte en rojo debido a la absorción de tinción con PI (no se muestra). El número de eventos necróticas y apoptóticas se cuantificó manualmente para cada punto de tiempo sobre la base de PI-positividad y la morfología nuclear. La quimioterapia muerte celular inducida por el cáncer frecuentemente resulta en un reclutamiento reactivo de células inmunes en tumores 2,4,5. Figura 4 muestra un ejemplo de esta respuesta del estroma para el tratamiento agudo con doxorrubicina. El MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; animal de c-fms-EGFP reflejado aquí se administró doxorrubicina (8 mg / kg en 1 x PBS) ip . aproximadamente 20 horas antes del inicio de la formación de imágenes, y recibido por hora PI ip inyecciones. durante la duración del experimento para visualizar la muerte celular. Los tiempos indicados representan el número de horas después de tratamiento con doxorrubicina, y la barra de escala representa 100 micras. En este experimento, las células mieloides se infiltran en las zonas de muerte celular, como se indica por las flechas blancas. Para cuantificar la infiltración de células mieloides en tumores después de la administración de doxorrubicina, el mismo tipo de análisis utilizado para determinar la distribución de medicamentos y la respuesta del tumor a la quimioterapia se utiliza, en donde la salida es cuantitativa por ciento de área por área total del tumor que es positiva para EGFP. Además de la visualización de la respuesta global del estroma a la quimioterapia, especializados respuestas estromales también se pueden visualizar 5. Película 4 muestra la fagocitosis de material celular necrótica por una célula vecina. El material nuclear rojo se puede ver que se ingiere por una célula con un large intacto núcleo verde, que es típico de los macrófagos. El MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; animales ACTB-H2B-EGFP fotografiado durante esta sesión se administró doxorrubicina (8 mg / kg en 1 x PBS) ip. 24 h antes del comienzo de la película. El animal recibió inyecciones por hora de 1 x PBS que contiene PI (Invitrogen, 1 mg / ml de solución diluida 1:15). Núcleos (ACTB-EGFP de etiquetado) aparecen como verde, pero de color rojo como la celda sufrir necrosis. Figura 1. Ejemplo de etiquetado de los diferentes componentes tumorales utilizando etiquetas transgénicos e inyectables Se trata de un triple-transgénicos MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal en el que las células cancerosas están marcados en azul a través de la expresión de las células mieloides ECFP y están etiquetados en verde a través de la expresión de EGFP desde un promotor específico de linaje mieloide. El animal se inyectó con yoduro de propidio (PI, rojo, ~ 0,07 mg / ml en 1X PBS) durantela sesión de formación de imágenes para visualizar la muerte celular. PI etiquetas de ADN, pero sólo atraviesa las membranas celulares de las células muertas o moribundas. Barra de escala = 100 micras. Figura 2. Extravasación y distribución de fármacos en tumores Esta doble transgénico MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP animal en el que las células cancerosas están etiquetadas en azul a través de la expresión de ECFP fue inyectado con FITC-dextrano conjugado 2 MD (verde) durante la sesión de formación de imágenes para visualizar cómo medicamentos lleguen a los tumores después de la inyección iv (azul). Tiempo después de la filmación se inició se indica. Barra de escala = 100 micras. Figura 3. Cáncer de la respuesta celular a la terapia sistémica. Un MMTV-PYMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal tratado con el agente quimioterapéuticodoxorrubicina, un medicamento antes de la imagen, y se inyecta con PI (rojo, ~ 0,07 mg / ml en PBS 1x) para etiquetar la muerte celular. Esta serie de imágenes muestra la acumulación de tinción con PI en el tiempo (como se indica por las flechas blancas), que representa la inducción de la muerte celular doxorrubicina tratamiento siguiente. El tiempo indicado es el tiempo tras el tratamiento con doxorubicina. Las imágenes son proyecciones de máxima intensidad de un z-stack que contiene tres imágenes en el eje z. Barra de escala = 100 micras. Figura 4. Respuesta de las células mieloides de la quimioterapia en un MMTV-PYMT; ACTB-ECFP;. Ratón c-fms-EGFP triples transgénicos doxorrubicina administrada 20 horas antes de la proyección de imagen El animal recibió ip por hora. inyecciones de PI (rojo, ~ 0,07 mg / ml en PBS 1x) para marcar las células muertas. Esta serie de imágenes muestra la acumulación de células mieloides EGFP-positivas (como se indica por las flechas blancas) con el tiempo tras doxorubicin tratamiento. Esta respuesta inmune reactiva se ha demostrado que impiden la respuesta terapéutica a varias clases de quimioterapias 4,5. El tiempo indicado es el tiempo tras el tratamiento con doxorubicina. Las imágenes son proyecciones de máxima intensidad de un z-stack que contiene tres imágenes en el eje z. Barra de escala = 100 micras. Película 1. . Suministro de fármaco en un tumor Este es un doble transgénico MMTV-PYMT; ACTB-ECFP animal en el que las células cancerosas están etiquetadas en azul a través de la expresión de ECFP. El animal fue inyectado con un 2 MD FITC-conjugado de dextrano (verde) durante la sesión de imágenes para visualizar cómo los medicamentos lleguen a los tumores después de la inyección iv. Barra de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver la película . Movie 2. Drogas infiltración en el tejido tumoral Un triple C3 transgénico (1)-Tag;. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal en el que las células cancerosas son laBeled en azul a través de la expresión de ECFP y células mieloides marcadas en verde a través de la expresión de EGFP se inyectaron iv con un Alexa Fluor 647-conjugado de dextrano 10 kD (rojo). El campo de visión se muestra inmediatamente después de la inyección con dextrano. El dextrano inicialmente etiquetas de la vasculatura, extravasa rápidamente en el tejido tumoral, y es finalmente tomado por los macrófagos. Barra de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver la película . Movie 3. Las imágenes de los cambios nucleares después de la muerte celular inducida por la quimioterapia Esta triples transgénicos MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP animal fue inyectado con doxorubicina antes de la imagen. La morfología nuclear (verde), según el seguimiento por la expresión de una proteína de fusión H2B-EGFP, permite la visualización directa de los cambios inducidos por la quimioterapia nucleares estructurales típicos de la apoptosis como se ha visto para la celda en la esquina superior derecha. Los animales receIVED cada media hora IP. inyecciones de PI (rojo) para la duración de la sesión de imágenes para marcar las células muertas y moribundas. El tiempo indicado es el tiempo después de la doxorrubicina tratamiento hr 24. Las imágenes fueron adquiridas usando una lente de aumento del objetivo de alto (40x, NA 1.1, lente de agua). Barra de escala = 15 m. Haga clic aquí para ver la película . Movie 4. Las imágenes de los cambios nucleares y la captación de material celular muerto después de la muerte celular inducida por la quimioterapia Esta triples transgénicos MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP animal fue inyectado con doxorubicina antes de la imagen. La morfología nuclear (verde), según el seguimiento por la expresión de una proteína de fusión H2B-EGFP, permite la visualización directa de la quimioterapia inducida por cambios estructurales nucleares. El animal recibió cada media hora IP. inyecciones de PI (rojo) para la duración de la sesión de imágenes para marcar las células muertas y moribundas. Las imágenes fueron adquiridasusando una lente de aumento del objetivo alto (40 x, 1,1 NA, lente de agua). La falta de cambios estructurales importantes antes de etiquetado con PI y el cambio en la morfología nuclear y la pérdida de la señal de GFP es indicativo de la muerte celular necrosis similar. El material muerto se ve siendo tomado por una célula con un núcleo grande, lo cual es típico de los macrófagos. El tiempo indicado es el tiempo después de la doxorrubicina tratamiento hr 24. Barra de escala = 10 m. Haga clic aquí para ver la película .

Discussion

Las respuestas de los tumores a terapias sistémicas in vivo puede ser drásticamente diferente a las de las células cancerosas in vitro, como el microambiente influye tanto en la respuesta aguda y la recaída ^5. Uno de los mayores obstáculos para la explicación de quimio-resistencia en las vías in vivo es la complejidad de las interacciones entre las células cancerosas y su microentorno. En particular, porque los tumores sólidos han desarrollado un equilibrio entre el cáncer y las células estromales, las perturbaciones de un componente, tales como la muerte celular que se produce durante el tratamiento contra el cáncer, puede resultar en efectos dramáticos en la organización del tejido.

La técnica de imagen intravital proporcionado aquí permite la visualización directa de cáncer de estroma de células interacciones dentro de los tumores de los ratones vivos, anestesiados durante el tratamiento con fármacos contra el cáncer. Utilizamos microscopía confocal disco giratorio, que tiene una profundidad de penetración relativa limitada (ver ¹⁷ ), pero nuestras técnicas quirúrgicas y el etiquetado puede ser utilizado con otros tipos de microscopía. Películas adquiridos a partir de estos experimentos se puede utilizar para el seguimiento de procesos que incluyen cambios en la intensidad de fluorescencia (por ejemplo, debido a la infiltración de una población marcada o la inducción de la muerte celular), la motilidad celular, la distribución de inyectables (por ejemplo, para el seguimiento de la pérdida vascular), y co- localización de las señales fluorescentes ^5,12,17,20.

En forma rutinaria ratones de imagen para más de 6 horas y las imágenes también se realizó hace más de 18 horas. Esto requiere el mantenimiento de los ratones continuamente bajo anestesia para estos períodos de tiempo largos. Con la anestesia adecuada, más del 90% de los animales a sobrevivir 6 horas, y aproximadamente el 80% sobrevive más de 18 horas. Los detalles sobre cómo llevar a cabo a largo plazo anestesia se han publicado previamente ^19. En nuestra experiencia, los cinco factores son fundamentales: evitar la hipotermia, evitando la deshidratación, el mantenimiento de los niveles fisiológicos de saturación de oxígeno en sangre, ucantar gas portador humidificado para el isoflurano, y de mantenimiento de los animales en el nivel más bajo de la anestesia en los que no muestran signos de dolor. Para mantener la temperatura corporal, es mantener a los ratones bajo una manta calentada (a 38 ° C). Para evitar la deshidratación, se inyectan pequeños volúmenes de solución salina intraperitoneal a lo largo de todo el procedimiento de imagen. Para mantener los niveles fisiológicos de saturación de oxígeno en sangre, se comienza con 21% de oxígeno en el gas portador (en lugar de los de uso común 100%). Esto nos permite aumentar los niveles de oxígeno inhalado si un ratón – horas en un experimento – muestra una disminución en la saturación de oxígeno en sangre. En nuestra experiencia, el aumento de los niveles de oxígeno inhalado en ese momento (por ejemplo, 30-40%) casi siempre se estabilizará el animal lo que permite horas de imágenes adicionales. El nivel óptimo de anestesia es para la mayoría de los ratones obtenidos con isoflurano 1-1.5% y los resultados de las tasas de respiración de 60-65/min y frecuencias de pulso de 400-450/min. En nuestros experimentos de imagen, usamos principalmente modelo de ratón transgénicos (MMTV-PYMT y C3 [1]-Tag) en el que los tumores son multifocales, permitiendo la obtención de imágenes de lesiones múltiples en diferentes etapas de la progresión tumoral en paralelo en múltiples x, posiciones en Y durante una sola sesión de imagen. Esto disminuye preocupaciones con respecto ratón-a-ratón de variación con respecto a los experimentos dirigidos a la identificación de fase dependientes de respuestas terapéuticas, y reduce el número de animales necesarios para la formación de imágenes.

El modelo MMTV-PYMT (y otros modelos de cáncer espontáneo) pasan por etapas progresivas histopatológicos que pueden ser reconocidos durante la exploración intravital, a pesar de la puesta en escena patológica de las lesiones tumorales que se pueden realizar durante la exploración intravital es diferente y menos detallada que la de secciones histológicas ^5,17. En contraste, los modelos de trasplante tienden a reflejar los tumores de etapa tardía mejor, como las células cancerosas generalmente están aislados de tumores avanzados. Tales modelos son por lo tanto más susceptibles a estudiar tumor-estromainteracciones de los tumores en estadios tardíos que diferencias en las interacciones entre las diferentes fases.

Nos muestran ejemplos de cómo reproducir nucleares cambios estructurales que ocurren después de la muerte celular inducida por la terapia. En ausencia de tratamiento contra el cáncer, esta estrategia de etiquetado en lugar se puede utilizar para la división de la imagen celular in situ, elucidar, por ejemplo, cómo la proliferación celular y la latencia está influenciado por el microentorno. En el futuro, el marcaje fluorescente de los componentes mitocondriales pueden hacer posible cambios de imagen mitocondriales que se producen durante la muerte celular apoptótica.

En este protocolo, también hemos demostrado ejemplos de cómo las interacciones de imágenes de células de cáncer de células inmunes después de la terapia, pero otros componentes microambientales también se pueden visualizar y formado la imagen. Existentes líneas transgénicas reportero para los componentes del estroma se encuentran las de los fibroblastos (por ej., FSP1-EGFP ^{17 de} αSMA-RFP ^21, COL1A1-EGFP ²¹⁾ o las células de la vasculatura (por ejemplo, Tie2-GFP ^22; VEGF-GFP ^23).

Intravital de imágenes permite la visualización en tiempo real de las interacciones y los procesos que se producen tr la administración in vivo después de la quimioterapia. Con la tecnología disponible en la actualidad, se han logrado importantes avances en la comprensión de cómo las células mieloides influyen en la respuesta terapéutica, sin embargo, debido a que el microambiente tumoral es tan complejo, los avances más importantes siguen siendo necesarios para empezar a profundizar de manera mecánica en los procesos que subyacen entorno mediado resistencia a los medicamentos. Uno de los avances más importantes que aún se requieren es la identificación de mejores marcadores de poblaciones celulares específicas. La importancia de los mejores marcadores está bien ilustrado con dos de los componentes celulares más prominentes del estroma del microambiente del tumor de mama, fibroblastos y células inmunes. α-actina de músculo liso (αSMA) se utiliza frecuentemente para identificarfibroblastos, pero la proteína se expresa también por células musculares lisas vasculares y células mioepiteliales ^24. Así, aunque αSMA-GFP reportero ratones existen, para determinar el tipo específico de célula es lo siguiente durante un experimento de imagen intravital es un reto. Del mismo modo, un único marcador fluorescente tal como EGFP expresa bajo el promotor c-fms menudo identificar subpoblaciones múltiples de células inmunes ^12,17. Así, aunque, idealmente, le gustaría utilizar un solo marcador para identificar un tipo celular específico de la complejidad de la biología subyacente plantea un desafío importante en el uso de este enfoque.

Una solución parcial a este problema es usar etiquetas inyectables para diferenciar las subpoblaciones de células que expresan el reportero fluorescente mismo. Por ejemplo, dextranos fluorescentes son captados por los macrófagos y se puede utilizar para etiquetar las subpoblaciones de macrófagos que están marcados por el c-fms-EGFP y FSP1-EGFP reportero ratones transgénicos 17. Los anticuerpos conjugados con sondas fluorescentes también se han utilizado para identificar subpoblaciones específicas (por ejemplo, la población Gr1-positivo de las células mieloides marcadas por el reportero c-fms-EGFP ^17).

A diferencia de las curvas de respuesta de tumor generados por el calibrador de medición, que proporcionan poca información mecanicista sobre cómo o por qué los tumores responden a la terapéutica administrada, o una serie histológico derivadas de tejidos cosechados en diferentes puntos temporales que requieren grandes cohortes de animales, nuestra técnica proporciona información directa, cuantificable en la dinámica de la muerte de la célula y en las interacciones de células estromales con células cancerosas en cohortes pequeñas. Por lo tanto, la ventaja de utilizar la técnica aquí es que proporciona información dinámica sobre las respuestas de drogas en el contexto de un microambiente tumoral intacta en tiempo real. Dicha información puede conducir a importantes conocimientos sobre los procesos subyacentes que impulsan las respuestas terapéuticas ^{5 <}/ Sup>.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a J. J. Qiu cappellani y de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional del Cáncer (U01 CA141451), el Consorcio de Cáncer Starr, Susan G. Komen for the Cure, Long Island 2 Caminata Día de Lucha contra el Cáncer de Mama, Manhasset Coalición de Mujeres contra el Cáncer de Mama para mí, y una pre-doctoral de becas del Programa de Investigación del Cáncer de mama Dirigida el Congreso, a ESNESN EE.UU. es también el destinatario de la rápida Leslie C. y William Randolph Hearst Becas de la Fundación de la Escuela Watson de Ciencias Biológicas. HAA fue apoyado por fondos del Consejo de Investigación de Noruega (160698/V40 y 151.882) y del Sureste Autoridades Regionales de Salud (2007060).

Materials

			Reagent
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
C3(1)-Tag mice	Jackson Laboratory	13591
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
ACTB-H2B-EGFP mice	Jackson Laboratory	5418
1 x PBS	Made in-house
2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated	Invitrogen	D-7137	Reconstitute in dH₂O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS
10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated	Invitrogen	D-22914	Reconstitute in dH₂O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS
Doxorubicin hydrochloride	Sigma-Aldrich	44583	Reconstitute in dH₂O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS
Isothesia (Isoflurane)	Butler Animal Health Supply	029450	250 ml
Propidium iodide	Invitrogen	P3566	1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS
Nitrogen
Oxygen
			Equipment
18G x 1½” regular bevel needle	BD	305196
μManager	Vale Lab, UCSF	www.micro-manager.org	Open-source software
Alcohol swab	BD	326895	70% isopropyl alcohol swabs
Anesthesia system	Molecular Imaging Products, Co.
Cover glass	Corning	2940-245	No. 1½, 24×50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes
Curity gauze sponges (sterile)	Kendall	6939
Glass microscope slides	Corning	2948-75×25	Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes
Hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-11	2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length
Heated blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Krazy Glue	Elmer’s Products	KG484
Laboratory tape ( ½”)
Laboratory tape (1″)
Lid to a Styrofoam shipping cooler			This will be used as the surgical platform
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5153	1×2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4″ length
Micro dissecting forceps	Roboz	RS-5135	Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4″ length
Microscope			Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility^17,25
Microscope stage insert	Applied Scientific Instrumentation		Custom fabricated, with two circular imaging ports
MouseOx oximeter, software, and sensors	STARR Life Sciences	www.starrlifesciences.com
Nalgene Super Versi-Dry lab soakers	Thermo Scientific	74218-00	Cut into fourths for lining surgical platform
Nebulizer	Salter Labs	8901	Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues
Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml)	BD	309659
Surflo winged infusion set	Terumo	SV-23BLK	23G x ¾” ultra thin needle, 12″ tubing
Betadine Spray	Purdue Pharma	BASP3H

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Live Imaging Drug Response Tumor Microenvironment Mouse Models Breast Cancer 3D Co-culture Tumor-stroma Interactions Spinning Disk Confocal Microscopy Systemic Therapy Cell Labeling Surgical Procedure Time-lapse Movies Image Analysis

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Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (73), e50088, doi:10.3791/50088 (2013).