İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Buffy Coats'tan Yüksek Verimli İmmünomanyetik Boncuk Ayırma ile İzole Edilmesi
Summary
Bu protokol, biyobankacılık ve diğer amaçlar için insan periferik kan mononükleer hücrelerini izole etmek için yüksek verimli otomasyonla uyumlu bir yöntemi detaylandırır.
Abstract
Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC’ler), monosit ve lenfositlerin heterojen bir popülasyonudur. Dondurularak saklanmış PBMC’ler, uzun süreli depolamada stabil canlılığa sahiptir, bu da onları akış sitometrisi, immünolojik testler ve genom dizilimi dahil olmak üzere birçok aşağı akış araştırma amacı için ideal bir hücre tipi haline getirir. Tipik olarak, PBMC’ler yoğunluk gradyan santrifüjleme yoluyla izole edilir, ancak bu, ölçeklendirilmesi zor ve maliyetli olan düşük verimli bir iş akışıdır. Bu makalede, uygulanması hızlı olan manyetik boncuk tabanlı bir PBMC izolasyon yöntemi kullanan yüksek aktarım hızına sahip bir iş akışı sunulmaktadır. Yoğunluk gradyan izolasyonu kullanılarak elde edilen PBMC’lerle toplam hücre konsantrasyonu, canlılığı ve popülasyon dağılımı karşılaştırıldı ve hücre canlılığı ve hücre tiplerinin oranı her iki teknik için karşılaştırılabilirdi. İzole PBMC’ler, kan alımından 9 gün sonrasına kadar %70’in üzerinde canlılık gösterdi, ancak verim, alımdan sonraki 24 saat içinde işlenen PBMC’lere kıyasla 5 gün sonra yarı yarıya azaldı. Özetle, bu makalede, yüksek aktarım hızına uyum sağlamak için boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanan bir PBMC protokolü açıklanmakta ve hem manuel hem de otomatik boncuk tabanlı yöntemlerin işleme kapasitesini artırabileceği ve çeşitli bütçeler için esneklik sağlayabileceği gösterilmektedir.
Introduction
Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) izolasyonu, lenfositleri ve monositleri diğer tam kan bileşenlerinden ayıran ve izole eden bir tekniktir. PBMC’ler, immünoterapi, aşı geliştirme, hedef veya biyobelirteç tanımlama ve antikor/küçük moleküllü ilaç geliştirmedahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok sayıda uygulama için kullanılan çok yönlü bir hücre tipidir 1,2. Bu hücreler sağlıklı veya hastalıklı bireylerden izole edilebilir ve sonraki süreçlerde hemen kullanılabilir veya gelecekteki araştırmalar için dondurularak saklanabilir3. Bazı durumlarda, aşağı akış amacı bilinirken, diğerlerinde, biyobankacılıkta yaygın olduğu gibi, PBMC’ler izole edilir ve gelecekteki belirtilmemiş uygulamalar için saklanır4.
Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, santrifüjleme sırasında hücre yoğunluğuna bağlı olarak kurucu hücre tiplerinin diferansiyel ayrımını kullanarak, PBMC’leri 5,6,7’yi tam kandan izole etmek için geleneksel tekniktir. Bu yöntemde bazı farklılıklar olsa da, tam kan genellikle fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir, özel veya standart bir santrifüj tüpünde bir yoğunluk gradyan ortamı üzerine katmanlanır ve daha sonra döndürülür. Dört farklı katman ortaya çıkar: üst plazma tabakası trombositlerle zenginleştirilir, ince bir PBMC tabakası yoğunluk gradyan ortamının üzerindedir ve son olarak alt tabaka kırmızı kan hücreleri (RBC’ler) ve granülositlerden oluşur. Bu yöntem daha önce ‘altın standart’8 olarak adlandırılmış olsa da, ölçek büyütme için uzun işlem süresi, santrifüj kapasitesi, diğer kan ürünlerinin (yani plazma ve eritrositler) ayrıştırılmasında zorluk ve otomatikleştirilmesinin zahmetli olması gibi sınırlamalar vardır. Bu yöntem9 için otomasyon mümkün olsa da, bir sıvı işleyicinin kapsamlı bir şekilde programlanmasını gerektirir (tam otomatik olacak bir santrifüj modülü ile) ve uzun bir süreç olarak kalacaktır.
Bundan böyle, manuel işleme için sekiz tutuculu bir mıknatıs veya tam otomatik işleme için bir cihaz ile immünomanyetik boncuk ayırma kullanan alternatif bir iş akışı sunulmaktadır. Bu yöntem, hücrelere eklenen ve istenmeyen hücre popülasyonlarını, bu durumda trombositleri, granülositleri ve RBC’leri bağlayan bir antikor kokteyli kullanır. Bu istenmeyen popülasyonlar daha sonra manyetik ayırma ile uzaklaştırılır ve monosit ve lenfosit popülasyonları, aşağı akış işlemine hazır olan negatif fraksiyonda bırakılır10. Bu negatif seçim yöntemi, antikor ve manyetik boncuk kompleksini PBMC’lerden çıkarmak için ek adımlar gerektiren pozitif seçim yöntemlerinden daha hızlıdır. Negatif seçim, hücre işlevselliğini korumanın bir yolu olarak tanımlandığı için ayrıca avantajlıdır11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan PBMC’leri, çok sayıda tahlil için kullanılan çok yönlü hücre tipleridir; Bununla birlikte, biyobankalar da dahil olmak üzere birçok laboratuvarda izolasyon verimi genellikle bir sınırlamadır16. Daha önce, NSW Sağlık Eyalet Çapında Biyobanka, yoğunluk gradyanı yöntemini kullanarak PBMC’leri izole etti. İşleme kapasitesini artırmak için yoğunluk gradyan ayırma yöntemi için otomasyon araştırıldı, ancak (i) steril bir ürün üretmek için bir HEPA ünitesinin ek gerekliliği ile tam otomatik olacak bir santrifüj ünitesine sahip bir sıvı işleyicinin maliyeti, (ii) programlama için eğitimli personel ve (iii) protokol testi için gereken süre dahil olmak üzere uygulamanın önündeki engeller belirlendi. Bu nedenle, bu çalışma alternatif yöntemleri araştırdı ve manuel ve otomatik işleme için kullanılabilecek ticari olarak elde edilen İnsan PBMC kitini belirledi. İşleme için gerekli ekipman standart (1,2 m uzunluğunda) bir biyolojik güvenlik kabinine sığdığı için sterilite sağlanır. Bu belge, kaliteden ödün vermeden verimliliği artırmak ve reaktif maliyetlerini düşürmek için üreticinin önerdiği protokol14’te yapılan değişiklikleri detaylandırmaktadır. Ek olarak, üreticinin protokolü, tam kan (adım 1.2), plazma (adım 2.2) ve orijinal kan tüpünden alıntı yapan RBC (adım 2.5) dahil olmak üzere gelecekteki araştırmalar için biyobanka örneklerine yönelik adımları detaylandırmak için genişletildi.
Bu çalışmada, üç PBMC izolasyon protokolü karşılaştırıldı: yoğunluk gradyan ayrımı, manuel ve otomatik boncuk tabanlı izolasyon. PBMC izolasyonundan önce buffy coat seyreltmesinin çıkarılması ve santrifüjler için kopma OFF gereksiniminin ortadan kaldırılması da dahil olmak üzere üreticinin manuel boncuk tabanlı protokolünde değişiklikler yapıldı, bu da araştırmacıların uyarlanabilir, uygun maliyetli ve yüksek verimli bir PBMC izolasyon protokolünü izlemesine olanak tanıdı. İlk olarak, yoğunluk gradyan ayrımını ve manuel boncuk bazlı tekniği karşılaştırmak için PBMC’leri izole etmek için sekiz eşleşen tam kan örneği kullanıldı. Daha da önemlisi, hücre popülasyonu dağılımları, hücre canlılığı ve PBMC’lerin geri kazanımı, sırasıyla Şekil 2A-F, Şekil 3A ve Ek Şekil 1’de gösterildiği gibi, karşılaştırılan iki yöntem arasında önemli ölçüde farklı değildi. Temsili verilerde, tripan mavisi dışlama yöntemi kullanılarak yoğunluk gradyan ayırma yöntemi için hücre sayıları daha yüksekti, ancak bir hematoloji hücre analizörü kullanıldığında değildi. Hücre sayacındaki PBMC hücre tipi ayarları, 8-50 μm’lik bir hücre çapı aralığı kullandı ve bu nedenle, sayımlar, tripan mavisi dışlama yöntemi17 kullanıldığında PBMC’lerin yanı sıra granülositleri (yaklaşık 12-15 μm çapında) içerecektir. Hematolojik hücre sayacı, tripan mavisi dışlama yönteminden daha yüksek özgüllük sunarken, bazı geri kazanım hesaplamaları, cihazın hata payını yansıtan %100’den yüksekti (bkz. Ek Şekil 1). Bu nedenle, çoğu teknik hem spesifik hem de oldukça hassas diferansiyel hücre sayımları sunmadığından, araştırmacıların PBMC izolasyon protokollerinden elde edilen verimleri karşılaştırırken hücre sayma tekniklerinin bir kombinasyonunu uygulamaları önerilir. Ayrıca, her iki teknikten elde edilen PBMC’lerin fonksiyonel aktivitesini karşılaştırmak için testler yapılmamıştır, bu da analizimizin bir sınırlamasıdır.
Daha sonra, manuel ve otomatik boncuk bazlı yöntemler karşılaştırıldı ve eşleşen 8 numuneden PBMC verimi veya canlılığı arasında önemli bir fark tespit edilmedi (Şekil 4A,B). Her iki yöntem için de aynı antikor izolasyon kokteyli kullanıldığından, hücre popülasyonları ayrı ayrı karşılaştırılmadı. Daha da önemlisi, 8 numuneyi işlemek için uygulamalı süre, otomatik protokol kullanılarak 43 dakikadan 22 dakikaya düşürüldü (Şekil 4C). Otomasyon kullanılarak verim, teknisyen tükenmişliğinin önlenmesi ve numune işlemenin tutarlılığı sağlanırken, reaktiflerin ve sarf malzemelerinin maliyeti, manuel boncuk bazlı yönteme göre 3-4 kat daha fazla önemli ölçüde daha yüksektir. Bu, üreticinin protokolünde önerilen 2-5 mL aralığı (10 mL ve/veya daha yüksek bir tam kan hacminden) yerine 1 mL buffy coat (10 mL’lik bir tam kan hacminden) kullanacak şekilde değişiklikler yaptıktan sonradır. Bütçe bir sınırlama ise, manuel yöntemin seçilmesi, yoğunluk ayırma yöntemiyle karşılaştırılabilir reaktif ve sarf malzemesi maliyetlerini korurken işlem süresini ~%25 oranında azaltabilir. 5 dakikalık inkübasyon süreleri içinde numunelerin yeterli şekilde kademelendirilmesini (~ 30 s/numune) sağlamak için teknisyen başına bir seferde en fazla 8 numunenin işlenmesi önerilir (aşama 3.7, 3.11 ve 3.14).
Hem manuel hem de otomatik boncuk bazlı yöntemlerde, buffy kaplamanın çıkarılması, optimum PBMC izolasyonunu sağlamak için kritik bir adımdır. Bu protokolde tam kan yerine buffy bir ceket kullanıldığına dikkat etmek önemlidir, çünkü reaktiflerin hacmi başlangıç materyalihacimleri 10’a dayanmaktadır. Tüm buffy coat hacmini etkili bir şekilde çıkarmak teknik olarak zor olabilir. Başlangıçta, bu yöntem 0.5 mL buffy coat çıkarılmasını detaylandırdı, ancak iyileşmeyi iyileştirmek için 1 mL’ye çıkarıldı. Buffy kaplamanın yeterli ve tutarlı bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için, bu sürecin detaylandırılması protokol dokümantasyonu ve eğitiminde önemlidir. Buffy kaplamayı aspire ederken bir pipet ucunu döndürmeniz ve alttaki katmandan çok fazla RBC aspire etmemeye dikkat etmeniz önerilir (adım 2.3). İstenmeyen hücreleri (yani granülositler ve kırmızı kan hücreleri) bağlayan antikor kokteylini doyurmamak önemlidir, bu da verimi ve saflığıetkileyebilir 10. Buffy coat ekstraksiyonu sırasında toplanan eritrositleri en aza indirmek için, pipet ucu plazma ve buffy coat tabakası arasında olmalıdır. Buffy kaplamanın hacmi 1 mL’den artırılabilir; bununla birlikte, toplanan hacmin %10’undan fazlasının RBC içermediğinden emin olmak için yukarıda açıklandığı gibi özen gösterilmelidir. Alternatif olarak, buffy kaplamaları tutarlı bir şekilde toplamak için otomatik bir sıvı işleyici kullanılabilir18. Bununla birlikte, özellikle masraf göz önüne alındığında, sıvı işleme cihazı protokollerini kalibre etmek ve sorun gidermek için gereken özel saatler çoğu laboratuvar için uygun olmayabilir.
NSW Health Statewide Biobank’ın önümüzdeki 3 yıl içinde 23.000 PBMC’yi işleme hedefi göz önüne alındığında, otomasyon boncuğu tabanlı protokolün geçişi ve uygulanması çok önemliydi. Burada, PBMC’lerin ACD tüplerinden toplamadan 9 güne kadar ortalama canlılık ile >% 70) izole edilebileceği gösterilmiştir. Toplamadan 24 saat sonra verim optimum olsa da, numunelerin taşınması gerekebileceğinden bu zaman dilimi içinde işleme her zaman mümkün değildir. Manuel veya otomatik boncuk bazlı yöntemle izole edilen PBMC’lerin, toplandıktan sonraki 4 gün içinde izole edildiğinde >3 x 105 hücre / mL tam kan ve 10 gün içinde izole edildiğinde >1 x 105 hücre / mL tam kan verimine sahip olabileceği gösterilmiştir. 5 günün üzerindeki numuneler için düşük sayılar, bu analizin bir sınırlaması olarak belirtilmiştir. Ayrıca, bu bilgiler mevcut olmadığı için veriler katılımcı yaşlarına, cinsiyetlerine ve klinik geçmişine göre ayrılmamıştır. Her iki yöntem için de işlem sürelerindeki gecikmelerin etkilerini incelemek için karşılaştırmalı bir analize ihtiyaç duyulmasına rağmen, daha önce yoğunluk gradyan yöntemi kullanılarak PBMC izolasyonundaki gecikmelerin hücre kalitesini düşürdüğü ve RBC kontaminasyonunu önemli ölçüde artırdığı bildirilmiştir 19,20. Ek olarak, işleme gecikirse granülosit oranları artar ve bu nedenle, benzer “yaşlara” sahip numuneler, sonraki analizler için gruplandırılmalıdır 20,21,22. Dikkat çekici bir şekilde, bu deney asit sitrik dekstroz (yani trisodyum sitrat, sitrik asit ve dekstroz) ile antikoagüle edilmiş kan kullanılarak gerçekleştirildi; bununla birlikte, diğer antikoagülanlar kullanılırsa hücre tiplerinin verimi ve/veya oranı değişebilir23; bu nedenle araştırmacılara, amaçlanan aşağı akış PBMC analizlerine dayalı olarak uygun bir antikoagülan seçmeleri önerilir.
Özetle, yüksek verimli iş akışlarına uyarlanabilen manyetik boncuklar kullanan bir PBMC izolasyonu protokolü, hücre canlılığından ödün vermeden ölçeklendirme gereksinimlerini karşılamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Hem manuel hem de otomatik yöntemler, başlatma ve yeniden süspansiyon hacimlerini değiştirerek spesifik hücre konsantrasyonları üretmek için optimize edilebilir. NSW Health Statewide Biobank, geleneksel yoğunluk gradyan ayırma tekniğini kullanarak ayda ~ 60 PBMC çıkarmaktan, bu otomasyonla uyumlu boncuk tabanlı yöntemi kullanarak ayda ~ 300 PBMC’ye geçiş yaptı. Yazarların bir sonraki hedefi, ayda 1200’e kadar PBMC’yi işlemek için otomatik platformu kullanmak ve hem manyetik boncuk tabanlı (manuel ve otomatik) hem de yoğunluk gradyan teknikleriyle izole edilen PBMC’leri daha fazla karşılaştırmak ve bu tekniğin uygulanmasına rehberlik etmek için özellikle biyobankalara odaklanan diğer laboratuvarlara rehberlik etmektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSW Sağlık Eyalet Çapında Biyobanka, NSW Sağlık Patolojisi, NSW Sağlık ve Tıbbi Araştırma Ofisi ve Sidney Yerel Sağlık Bölgesi’nden gelen desteği minnetle kabul eder. Ek olarak, yazarlar, kurum içi oluşturulan verileri yayınlama ve kullanılmayan örnekleri araştırma amacıyla kullanma izni verdiği için Omico ve NSW Health Statewide Biobank tarafından desteklenen diğer araştırma çalışmalarına minnetle teşekkür eder. Yazarlar, eleştirel liderlik ve tartışmalar için Profesör Jennifer Bryne’a (NSW Sağlık Patolojisi, Sidney Üniversitesi) teşekkür eder. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR) | StemCellTM Technologies | 07930 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo ScientififcTM | 51033311 | |
| CoolCell 1 mL FX | BioTools | BCS-407P | This is the control rate freezing container used. |
| Distilled Water | Bacto Laboratories | 561832 | |
| DxH 500 Hematology Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | B40601 | Referred to as external automated cell counter. |
| EasyEightsTM EasySepTM Magnet | StemCellTM Technologies | 18103 | |
| EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit | StemCellTM Technologies | 19654 | Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich Pty Ltd | E6758-500G | Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2. |
| LymphoprepTM Density Gradient Medium | StemCellTM Technologies | 7851 | |
| Megafuge ST4 Plus Centrifuge | Thermo ScientififcTM | THR75009903 | |
| Orion Star A211 pH meter electrode | Thermo ScientififcTM | STARA2110 | |
| Orion™ ROSS Ultra™ Glass Triode™ pH/ATC Combination Electrodes | Thermo ScientififcTM | 8302BNURCA | |
| Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 10010023 | |
| Prism | GraphPad | ||
| RoboSepTM Buffer 1X | StemCellTM Technologies | 20104 | Software used for statistical analysis. |
| RoboSepTM-S | StemCellTM Technologies | 21000 | Fully automated cell separator instrument. |
| RoboSep™ Filter Tips | StemCellTM Technologies | 20125 | |
| SepMateTM-50 (IVD) tubes | StemCellTM Technologies | 85460 | IVD – In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes |
| Vi-CELL XR Cell Anlayzer | Beckman Coulter Life Sciences | Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196). | |
| Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit | Beckman Coulter Life Sciences | 383722 |
References
- Alexovic, M., et al. Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications. Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).
- Zhang, M., Huang, B. The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells. Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).
- Kleeberger, C. A., et al. Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).
- Gautam, A., et al. Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods. PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).
- Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells. Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).
- Coppola, L., et al. Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation. J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).
- Stemcell Technologies. . 27156, (2020).
- Hornschuh, M., et al. Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes. Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).
- Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour. F1000Res. 6, 2045 (2017).
- Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage. Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).
- Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Available from: https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html (2022)
- . Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use Available from: https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf (2017)
- Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).
- Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. . Histology, white blood cell. , (2024).
- Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study. Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).
- Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
- Yi, P. C., et al. Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays. J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).
- Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function. J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society. Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).
.