Isolando células mononucleares do sangue periférico humano de Buffy Coats por meio de separação de esferas imunomagnéticas de alto rendimento

PBMCs humanos são tipos de células versáteis usados para vários ensaios; no entanto, o rendimento do isolamento costuma ser uma limitação em muitos laboratórios, incluindo biobancos¹⁶. Anteriormente, o NSW Health Statewide Biobank isolou PBMCs usando o método de gradiente de densidade. A automação foi investigada para o método de separação de gradiente de densidade para aumentar a capacidade de processamento, mas foram identificadas barreiras à implementação, incluindo (i) o custo de um manipulador de líquidos com uma unidade de centrifugação a ser totalmente automatizada, com a necessidade adicional de uma unidade HEPA para produzir um produto estéril, (ii) pessoal treinado para programação e (iii) tempo necessário para teste de protocolo. Portanto, este estudo explorou métodos alternativos e identificou o kit PBMC humano obtido comercialmente que poderia ser usado para processamento manual e automatizado. A esterilidade é garantida, pois o equipamento necessário para o processamento se encaixa em uma cabine de segurança biológica padrão (comprimento de 1,2 m). Este artigo detalha as modificações feitas no protocolo¹⁴ recomendado pelo fabricante, para aumentar a eficiência e reduzir os custos dos reagentes sem sacrificar a qualidade. Além disso, o protocolo do fabricante foi estendido para detalhar as etapas das amostras do biobanco para pesquisas futuras, incluindo sangue total (etapa 1.2), plasma (etapa 2.2) e hemácias (etapa 2.5) alíquotas do tubo de sangue original, bem como contagem de células e criopreservação.

Neste estudo, três protocolos de isolamento PBMC foram comparados: separação por gradiente de densidade, isolamento manual e automatizado baseado em cordão. Foram feitas modificações no protocolo manual baseado em esferas do fabricante, incluindo a remoção da diluição do revestimento leucocitário antes do isolamento de PBMC e a eliminação da exigência de interrupção para centrifugações, permitindo que os investigadores sigam um protocolo de isolamento PBMC adaptável, econômico e de alto rendimento. Primeiro, oito amostras de sangue total combinadas foram usadas para isolar PBMCs para comparar a separação do gradiente de densidade e a técnica manual baseada em esferas. É importante ressaltar que as distribuições da população celular, a viabilidade celular e a recuperação de PBMCs não foram significativamente diferentes entre os dois métodos comparados, conforme mostrado na Figura 2A-F, Figura 3A e Figura Suplementar 1, respectivamente. Nos dados representativos, as contagens de células foram maiores para o método de separação do gradiente de densidade usando o método de exclusão de azul de tripano, mas não quando um analisador de células hematológicas foi usado. As configurações do tipo de célula PBMC no contador de células empregaram uma faixa de diâmetro de célula de 8-50 μm e, portanto, as contagens incluirão PBMCs, bem como granulócitos (aproximadamente 12-15 μm de diâmetro) ao usar o método de exclusão de azul de tripano¹⁷. Embora o contador de células hematológicas tenha oferecido maior especificidade do que o método de exclusão do azul de tripano, alguns cálculos de recuperação foram superiores a 100%, refletindo a margem de erro do instrumento (ver Figura 1 suplementar). Recomenda-se, portanto, que os investigadores apliquem uma combinação de técnicas de contagem de células ao comparar os rendimentos dos protocolos de isolamento de PBMC, pois a maioria das técnicas não oferece contagens diferenciais de células específicas e altamente sensíveis. Além disso, não foram realizados ensaios para comparar a atividade funcional das PBMCs produzidas em ambas as técnicas, o que é uma limitação de nossa análise.

Em seguida, os métodos manuais e automatizados baseados em grânulos foram comparados, e nenhuma diferença significativa entre o rendimento ou a viabilidade do PBMC foi identificada em 8 amostras pareadas (Figura 4A, B). As populações de células não foram comparadas individualmente, pois o mesmo coquetel de isolamento de anticorpos foi usado para ambos os métodos. É importante ressaltar que o tempo prático para processar 8 amostras foi reduzido de 43 min para 22 min usando o protocolo automatizado (Figura 4C). Embora o rendimento, a prevenção do esgotamento do técnico e a consistência do processamento de amostras sejam garantidos usando automação, o custo de reagentes e consumíveis é significativamente maior, 3-4 vezes maior do que o método manual baseado em esferas. Isso ocorre depois de fazer modificações no protocolo do fabricante para usar 1 mL de buffy coat (de um volume de sangue total de 10 mL) em vez da faixa recomendada de 2-5 mL (de um volume de sangue total de 10 mL ou mais). Se o orçamento for uma limitação, optar pelo método manual pode reduzir o tempo de processamento em ~25%, mantendo os custos de reagentes e consumíveis comparáveis aos do método de separação por densidade. Recomenda-se processar no máximo 8 amostras por vez por técnico para garantir o escalonamento adequado das amostras (~30 s/amostra) dentro dos períodos de incubação de 5 minutos (etapas 3.7, 3.11 e 3.14).

Tanto no método manual quanto no automatizado, a remoção do revestimento buffy é uma etapa crítica para garantir o isolamento ideal do PBMC. É importante notar que um buffy coat em vez de sangue total é usado neste protocolo, pois o volume de reagentes é baseado nos volumes de material inicial¹⁰. A remoção eficaz de todo o volume do revestimento leucocitário pode ser tecnicamente desafiadora. Inicialmente, esse método detalhava a remoção de 0,5 mL de buffy coat, porém foi aumentado para 1 mL para melhorar a recuperação. Para garantir a recuperação adequada e consistente do buffy coat, detalhar esse processo é importante na documentação e no treinamento do protocolo. Recomenda-se girar a ponta de uma pipeta enquanto aspira o revestimento leucocitário, tomando cuidado para não aspirar muitas hemácias da camada abaixo (etapa 2.3). É importante não saturar o coquetel de anticorpos que se liga às células indesejadas (ou seja, granulócitos e glóbulos vermelhos), o que pode afetar o rendimento e a pureza¹⁰. Para minimizar as hemácias coletadas durante a extração do revestimento leucocitário, a ponta da pipeta deve estar entre a camada de plasma e o revestimento leucocitário. O volume do revestimento leucocitário pode ser aumentado de 1 mL; no entanto, deve-se tomar cuidado, conforme descrito acima, para garantir que não mais do que 10% do volume coletado contenha hemácias. Alternativamente, um manipulador automatizado de líquidos pode ser usado para coletar buffy coats de forma consistente¹⁸. No entanto, as horas dedicadas necessárias para calibrar e solucionar problemas de protocolos de instrumentos de manuseio de líquidos, especialmente considerando a despesa, podem não ser viáveis para a maioria dos laboratórios.

A transição e aplicação do protocolo baseado em esferas de automação foi essencial, dado o objetivo do NSW Health Statewide Biobank de processar 23.000 PBMCs nos próximos 3 anos. Aqui, foi demonstrado que as PBMCs podem ser isoladas de tubos de ACD até 9 dias após a coleta com viabilidades médias >70%. Embora os rendimentos tenham sido ótimos 24 horas após a coleta, o processamento dentro desse período nem sempre é viável, pois as amostras podem precisar ser transportadas. Foi demonstrado que as PBMCs isoladas com o método manual ou automatizado baseado em esferas podem ter rendimentos de >3 x 10⁵ células/mL de sangue total quando isoladas dentro de 4 dias após a coleta e >1 x 10,5 células/mL de sangue total quando isoladas dentro de 10 dias após a coleta. Números baixos para amostras acima de 5 dias são observados como uma limitação desta análise. Além disso, os dados não foram separados com base na idade, sexo e história clínica dos participantes, pois essas informações não foram disponibilizadas. Embora uma análise comparativa seja necessária para examinar os efeitos dos atrasos nos tempos de processamento para ambos os métodos, foi relatado anteriormente que atrasos no isolamento de PBMC usando o método de gradiente de densidade diminuem a qualidade celular e aumentam significativamente a contaminação de hemácias^19,20. Além disso, as proporções de granulócitos aumentam se o processamento for retardado e, portanto, espécimes de “idades” semelhantes devem ser agrupados para análises a jusante 20,21,22. É importante notar que este experimento foi realizado usando sangue anticoagulado com dextrose cítrica ácida (ou seja, citrato trissódico, ácido cítrico e dextrose); no entanto, o rendimento e/ou proporção de tipos celulares pode variar se outros anticoagulantes forem usados²³; portanto, os investigadores são aconselhados a escolher um anticoagulante apropriado com base nas análises de PBMC a jusante pretendidas.

Em resumo, um protocolo para isolamento de PBMC usando esferas magnéticas que é adaptável a fluxos de trabalho de alto rendimento é detalhado para atender aos requisitos de dimensionamento sem comprometer a viabilidade celular. Tanto o método manual quanto o automatizado podem ser otimizados para produzir concentrações celulares específicas, alterando os volumes inicial e de ressuspensão. O NSW Health Statewide Biobank fez a transição da extração de ~ 60 PBMCs por mês usando a técnica tradicional de separação de gradiente de densidade para ~ 300 PBMCs por mês usando este método baseado em esferas compatível com automação. O próximo objetivo dos autores é usar a plataforma automatizada para processar até 1200 PBMCs por mês e comparar ainda mais PBMCs isolados por técnicas baseadas em esferas magnéticas (manuais e automatizadas) e gradiente de densidade para orientar a implementação dessa técnica para outros laboratórios com foco particular em biobancos.