عزل خلايا الدم البشرية الطرفية أحادية النواة من معاطف بافي عبر فصل حبة مغناطيسية مناعية عالية الإنتاجية
Summary
يفصل هذا البروتوكول طريقة متوافقة مع الأتمتة عالية الإنتاجية لعزل خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحيطية لأغراض البنوك الحيوية وأغراض أخرى.
Abstract
خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية. تتمتع PBMCs المحفوظة بالتبريد بصلاحية مستقرة في التخزين طويل الأجل ، مما يجعلها نوعا مثاليا من الخلايا للعديد من أغراض البحث النهائية ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي والمقايسات المناعية وتسلسل الجينوم. عادة ، يتم عزل PBMCs عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة ، ومع ذلك ، فهو سير عمل منخفض الإنتاجية يصعب ومكلف توسيع نطاقه. تقدم هذه المقالة سير عمل عالي الإنتاجية باستخدام طريقة عزل PBMC المستندة إلى حبة مغناطيسية سريعة التنفيذ. تمت مقارنة التركيز الكلي للخلايا وصلاحيتها وتوزيعها مع PBMCs التي تم الحصول عليها باستخدام عزل تدرج الكثافة ، وكانت صلاحية الخلية ونسبة أنواع الخلايا قابلة للمقارنة لكلتا التقنيتين. أظهرت PBMCs المعزولة أكثر من 70٪ من الصلاحية حتى 9 أيام بعد جمع الدم ، على الرغم من انخفاض المحصول بمقدار النصف بعد 5 أيام مقارنة ب PBMCs التي تمت معالجتها في غضون 24 ساعة من جمعها. باختصار، توضح هذه المقالة بروتوكول PBMC الذي يستخدم نهجا قائما على الخرزة للتكيف مع سير عمل عالي الإنتاجية ويوضح أن كلا من الأساليب اليدوية والآلية المستندة إلى الخرز يمكن أن تزيد من قدرة المعالجة وتوفر المرونة للميزانيات المختلفة.
Introduction
عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMC) هي تقنية تفصل وتعزل الخلايا الليمفاوية والوحيدات عن مكونات الدم الكاملة الأخرى. PBMCs هي نوع من الخلايا متعددة الاستخدامات تستخدم في العديد من التطبيقات بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، العلاج المناعي ، وتطوير اللقاح ، وتحديد الهدف أو العلامات الحيوية ، وتطوير الأدوية ذات الأجسام المضادة / الجزيئاتالصغيرة 1,2. يمكن عزل هذه الخلايا عن الأفراد الأصحاء أو المرضى ويمكن استخدامها على الفور في عمليات المصب أو حفظها بالتبريد للبحث المستقبلي3. في بعض الحالات ، يكون الغرض النهائي معروفا ، بينما في حالات أخرى ، كما هو شائع في البنوك الحيوية ، يتم عزل PBMCs وتخزينها لتطبيقات مستقبلية غير محددة4.
الطرد المركزي المتدرج الكثافة هو التقنية التقليدية لعزل PBMCs5،6،7 من الدم الكامل ، باستخدام الفصل التفاضلي لأنواع الخلايا المكونة بناء على كثافة الخلية أثناء الطرد المركزي. في حين أنه قد يكون هناك بعض الاختلاف في هذه الطريقة ، يتم تخفيف الدم الكامل بشكل عام باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ويتم وضعه فوق وسط تدرج الكثافة في أنبوب طرد مركزي متخصص أو قياسي ، ثم يتم غزله. ينتج عن ذلك أربع طبقات متميزة: طبقة البلازما العلوية غنية بالصفائح الدموية ، وطبقة PBMC رقيقة فوق وسط تدرج الكثافة ، وأخيرا ، تتكون الطبقة السفلية من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) والخلايا المحببة. على الرغم من أن هذه الطريقة قد أطلق عليها سابقا اسم “المعيار الذهبي”8 ، إلا أن هناك قيودا على التوسع ، مثل وقت المعالجة الطويل ، وقدرة أجهزة الطرد المركزي ، وصعوبة اقتباس منتجات الدم الأخرى (مثل البلازما وكرات الدم الحمراء) ، وكونها شاقة للأتمتة. في حين أن الأتمتة ممكنة لهذه الطريقة9 ، إلا أنها تتطلب برمجة شاملة لمعالج سائل (مع وحدة طرد مركزي لتكون مؤتمتة بالكامل) وستظل عملية طويلة.
من الآن فصاعدا ، يتم تقديم سير عمل بديل يستخدم فصل الخرزة المغناطيسية المناعية إما بمغناطيس ثمانية حاملات للمعالجة اليدوية أو أداة للمعالجة المؤتمتة بالكامل. تستخدم هذه الطريقة كوكتيل الأجسام المضادة الذي يضاف إلى الخلايا ويربط مجموعات الخلايا غير المرغوب فيها ، في هذه الحالة ، الصفائح الدموية والخلايا المحببة وكرات الدم الحمراء. تتم إزالة هذه المجموعات غير المرغوب فيها لاحقا عن طريق الفصل المغناطيسي ، تاركة مجموعات الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية في الجزء السالب الجاهز للمعالجةالنهائية 10. طريقة الانتقاء السلبي هذه أسرع من طرق الانتقاء الإيجابي التي تتطلب خطوات إضافية لإزالة الجسم المضاد ومركب الخرزة المغناطيسية من PBMCs. يعد الاختيار السلبي مفيدا أيضا حيث تم وصفه بأنه طريقة للحفاظ على وظائف الخلية11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
PBMCs البشرية هي أنواع خلايا متعددة الاستخدامات تستخدم في العديد من المقايسات. ومع ذلك ، غالبا ما يكون معدل إنتاجية العزل قيدا في العديد من المختبرات ، بما في ذلك Biobanks16. في السابق ، قام البنك الحيوي على مستوى الولاية الصحية في نيو ساوث ويلز بعزل PBMCs باستخدام طريقة تدرج الكثافة. تم التحقيق في الأتمتة لطريقة فصل تدرج الكثافة لزيادة قدرة المعالجة ، ولكن تم تحديد العوائق التي تحول دون التنفيذ ، بما في ذلك (i) تكلفة معالج السوائل مع وحدة الطرد المركزي لتكون مؤتمتة بالكامل ، مع المتطلبات الإضافية لوحدة HEPA لإنتاج منتج معقم ، (ii) موظفين مدربين على البرمجة ، و (iii) الوقت اللازم لاختبار البروتوكول. لذلك ، استكشفت هذه الدراسة طرقا بديلة وحددت مجموعة PBMC البشرية التي تم الحصول عليها تجاريا والتي يمكن استخدامها للمعالجة اليدوية والآلية. يتم ضمان العقم لأن المعدات المطلوبة للمعالجة تتناسب مع خزانة السلامة البيولوجية القياسية (بطول 1.2 متر). تفصل هذه الورقة التعديلات التي تم إجراؤها على البروتوكول14 الموصى به من قبل الشركة المصنعة ، لزيادة الكفاءة وخفض تكاليف الكاشف دون التضحية بالجودة. بالإضافة إلى ذلك ، تم توسيع بروتوكول الشركة المصنعة لتفصيل خطوات عينات البنك الحيوي للبحث المستقبلي ، بما في ذلك الدم الكامل (الخطوة 1.2) ، والبلازما (الخطوة 2.2) ، و RBC (الخطوة 2.5) من أنبوب الدم الأصلي ، وكذلك عد الخلايا والحفظ بالتبريد.
في هذه الدراسة ، تمت مقارنة ثلاثة بروتوكولات عزل PBMC: فصل تدرج الكثافة ، والعزل اليدوي ، والآلي القائم على الخرز. تم إجراء تعديلات على بروتوكول الشركة المصنعة اليدوي القائم على الخرز ، بما في ذلك إزالة تخفيف معطف بافي قبل عزل PBMC ، وإلغاء متطلبات انقطاع التيار الكهربائي لأجهزة الطرد المركزي ، مما يسمح للمحققين باتباع بروتوكول عزل PBMC قابل للتكيف وفعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية. أولا ، تم استخدام ثماني عينات دم كاملة متطابقة لعزل PBMCs لمقارنة فصل تدرج الكثافة والتقنية اليدوية القائمة على الخرز. الأهم من ذلك ، أن توزيعات مجموعات الخلايا ، وصلاحية الخلية ، واستعادة PBMCs لم تكن مختلفة بشكل كبير بين الطريقتين المقارنتين ، كما هو موضح في الشكل 2A-F ، والشكل 3A ، والشكل التكميلي 1 ، على التوالي. في البيانات التمثيلية ، كان عدد الخلايا أعلى لطريقة فصل تدرج الكثافة باستخدام طريقة استبعاد تريبان الأزرق ولكن ليس عند استخدام محلل خلايا أمراض الدم. استخدمت إعدادات نوع خلية PBMC على عداد الخلية نطاق قطر الخلية من 8-50 ميكرومتر ، وبالتالي ، ستشمل الأعداد PBMCs وكذلك الخلايا المحببة (قطرها حوالي 12-15 ميكرومتر) عند استخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق17. في حين أن عداد الخلايا الدموية قدم خصوصية أعلى من طريقة استبعاد التريبان الأزرق ، كانت بعض حسابات الاسترداد أعلى من 100٪ ، مما يعكس هامش الخطأ في الأداة (انظر الشكل التكميلي 1). لذلك ، يوصى بأن يطبق الباحثون مجموعة من تقنيات عد الخلايا عند مقارنة العوائد من بروتوكولات عزل PBMC ، لأن معظم التقنيات لا تقدم كلا من تعداد الخلايا التفاضلية المحددة والحساسة للغاية. علاوة على ذلك ، لم يتم إجراء المقايسات لمقارنة النشاط الوظيفي ل PBMCs الناتجة عن أي من التقنيتين ، وهو قيد على تحليلنا.
بعد ذلك ، تمت مقارنة الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز ، ولم يتم تحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين إنتاجية PBMC أو صلاحيتها من 8 عينات متطابقة (الشكل 4 أ ، ب). لم تتم مقارنة مجموعات الخلايا بشكل فردي ، حيث تم استخدام نفس كوكتيل عزل الأجسام المضادة لكلتا الطريقتين. الأهم من ذلك ، تم تقليل الوقت العملي لمعالجة 8 عينات من 43 دقيقة إلى 22 دقيقة باستخدام البروتوكول الآلي (الشكل 4C). في حين يتم ضمان الإنتاجية ، والوقاية من إرهاق الفني ، واتساق معالجة العينات باستخدام الأتمتة ، فإن تكلفة الكواشف والمواد الاستهلاكية أعلى بكثير عند 3-4 أضعاف أكثر من الطريقة اليدوية القائمة على الخرز. هذا بعد إجراء تعديلات على بروتوكول التصنيع لاستخدام 1 مل من معطف بافي (من حجم دم كامل يبلغ 10 مل) بدلا من النطاق الموصى به من 2-5 مل (من حجم دم كامل يبلغ 10 مل و / أو أكثر). إذا كانت الميزانية قيدا ، فإن اختيار الطريقة اليدوية يمكن أن يقلل من وقت المعالجة بنسبة ~ 25٪ مع الحفاظ على تكاليف الكاشف والتكاليف الاستهلاكية المماثلة لتلك الخاصة بطريقة فصل الكثافة. يوصى بمعالجة ما لا يزيد عن 8 عينات في المرة الواحدة لكل فني لضمان تداخل العينات بشكل كاف (~ 30 ثانية / عينة) خلال فترات الحضانة البالغة 5 دقائق (الخطوات 3.7 و 3.11 و 3.14).
في كل من الطرق اليدوية والآلية القائمة على الخرز ، تعد إزالة معطف بافي خطوة حاسمة لضمان عزل PBMC الأمثل. من المهم ملاحظة أنه يتم استخدام معطف بافي بدلا من الدم الكامل في هذا البروتوكول حيث يعتمد حجم الكواشف على أحجام المواد الأولية10. يمكن أن تكون إزالة حجم معطف بافي بالكامل بشكل فعال تحديا تقنيا. في البداية ، قامت هذه الطريقة بإزالة 0.5 مل من معطف بافي ، ولكن تم زيادته إلى 1 مل لتحسين التعافي. لضمان التعافي الكافي والمتسق لمعطف بافي ، فإن تفصيل هذه العملية مهم في توثيق البروتوكول والتدريب. يوصى بتدوير طرف ماصة أثناء شفط معطف بافي مع الحرص على عدم استنشاق الكثير من كرات الدم الحمراء من الطبقة أدناه (الخطوة 2.3). من المهم عدم تشبع كوكتيل الأجسام المضادة الذي يربط الخلايا غير المرغوب فيها (أي الخلايا المحببة وخلايا الدم الحمراء) ، والتي يمكن أن تؤثر على المحصول والنقاء10. لتقليل كرات الدم الحمراء التي تم جمعها أثناء استخراج معطف بافي ، يجب أن يكون طرف الماصة بين طبقة معطف البلازما وطبقة معطف بافي. يمكن زيادة حجم معطف بافي من 1 مل ؛ ومع ذلك ، يجب توخي الحذر كما هو موضح أعلاه للتأكد من أن ما لا يزيد عن 10٪ من الحجم الذي تم جمعه يحتوي على كرات الدم الحمراء. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام معالج سائل آلي لجمع معاطف بافي باستمرار18. ومع ذلك ، فإن الساعات المخصصة المطلوبة لمعايرة بروتوكولات أدوات مناولة السوائل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، خاصة بالنظر إلى النفقات ، قد لا تكون مجدية لمعظم المختبرات.
كان انتقال وتطبيق البروتوكول القائم على حبة الأتمتة أمرا ضروريا نظرا لهدف البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز لمعالجة 23000 PBMCs على مدار سنوات 3 القادمة. هنا ، تم إثبات أنه يمكن عزل PBMCs من أنابيب ACD حتى 9 أيام من التجميع بمتوسط جدوى >70٪. في حين أن الغلة كانت مثالية بعد 24 ساعة من التجميع ، فإن المعالجة ضمن هذا الإطار الزمني ليست ممكنة دائما حيث قد يلزم نقل العينات. وقد تبين أن PBMCs المعزولة إما بالطريقة اليدوية أو الآلية القائمة على الخرز قد يكون لها غلة >3 × 105 خلايا / مل دم كامل عند عزلها في غضون 4 أيام من الجمع و >1 × 105 خلايا / مل دم كامل عند عزلها في غضون 10 أيام من جمعها. ويلاحظ انخفاض أعداد العينات التي تزيد عن 5 أيام كقيد على هذا التحليل. علاوة على ذلك ، لم يتم فصل البيانات بناء على أعمار المشاركين وجنسهم والتاريخ السريري ، حيث لم يتم توفير هذه المعلومات. على الرغم من الحاجة إلى تحليل مقارن لفحص آثار التأخير في أوقات المعالجة لكلتا الطريقتين ، فقد تم الإبلاغ سابقا عن أن التأخير في عزل PBMC باستخدام طريقة تدرج الكثافة يقلل من جودة الخلية ويزيد بشكل كبير من تلوث كرات الدم الحمراء 19,20. بالإضافة إلى ذلك ، تزداد نسب المحببات إذا تأخرت المعالجة ، وبالتالي ، يجب تجميع العينات ذات “الأعمار” المتشابهة للتحليلات النهائية20،21،22. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التجربة أجريت باستخدام مضادات تخثر الدم مع سكر العنب الحمضي (أي سترات الصوديوم وحامض الستريك وسكر العنب). ومع ذلك ، قد يختلف العائد و / أو نسبة أنواع الخلايا إذا تم استخدام مضادات التخثر الأخرى23 ؛ لذلك ينصح الباحثون باختيار مضاد تخثر مناسب بناء على تحليلات PBMC المقصودة.
باختصار ، تم تفصيل بروتوكول لعزل PBMC باستخدام حبات مغناطيسية قابلة للتكيف مع سير العمل عالي الإنتاجية لتلبية متطلبات القياس دون المساس بصلاحية الخلية. يمكن تحسين كل من الطرق اليدوية والآلية لإنتاج تركيزات معينة للخلايا عن طريق تغيير أحجام البدء وإعادة التعليق. انتقل البنك الحيوي على مستوى ولاية نيو ساوث ويلز للصحة من استخراج ~ 60 PBMCs شهريا باستخدام تقنية فصل تدرج الكثافة التقليدية إلى ~ 300 PBMCs شهريا باستخدام هذه الطريقة القائمة على الخرز المتوافقة مع الأتمتة. الهدف التالي للمؤلفين هو استخدام المنصة الآلية لمعالجة ما يصل إلى 1200 PBMCs شهريا ومقارنة PBMCs المعزولة بواسطة كل من تقنيات الحبيبات المغناطيسية (اليدوية والآلية) وتدرج الكثافة لتوجيه تنفيذ هذه التقنية إلى مختبرات أخرى مع التركيز بشكل خاص على البنوك الحيوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف البنك الحيوي الصحي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز بامتنان بالدعم المقدم من علم الأمراض الصحية في نيو ساوث ويلز ، ومكتب نيو ساوث ويلز للبحوث الصحية والطبية ، ومنطقة سيدني الصحية المحلية. بالإضافة إلى ذلك ، يعترف المؤلفون بامتنان ب Omico والدراسات البحثية الأخرى التي يدعمها البنك الحيوي على مستوى الولاية في نيو ساوث ويلز لمنح الإذن بنشر البيانات التي تم إنشاؤها داخليا واستخدام العينات غير المستخدمة لأغراض البحث. يشكر المؤلفون البروفيسور جينيفر براين (علم الأمراض الصحية في نيو ساوث ويلز ، جامعة سيدني) على القيادة والمناقشات النقدية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR) | StemCellTM Technologies | 07930 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo ScientififcTM | 51033311 | |
| CoolCell 1 mL FX | BioTools | BCS-407P | This is the control rate freezing container used. |
| Distilled Water | Bacto Laboratories | 561832 | |
| DxH 500 Hematology Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | B40601 | Referred to as external automated cell counter. |
| EasyEightsTM EasySepTM Magnet | StemCellTM Technologies | 18103 | |
| EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit | StemCellTM Technologies | 19654 | Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich Pty Ltd | E6758-500G | Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2. |
| LymphoprepTM Density Gradient Medium | StemCellTM Technologies | 7851 | |
| Megafuge ST4 Plus Centrifuge | Thermo ScientififcTM | THR75009903 | |
| Orion Star A211 pH meter electrode | Thermo ScientififcTM | STARA2110 | |
| Orion™ ROSS Ultra™ Glass Triode™ pH/ATC Combination Electrodes | Thermo ScientififcTM | 8302BNURCA | |
| Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 10010023 | |
| Prism | GraphPad | ||
| RoboSepTM Buffer 1X | StemCellTM Technologies | 20104 | Software used for statistical analysis. |
| RoboSepTM-S | StemCellTM Technologies | 21000 | Fully automated cell separator instrument. |
| RoboSep™ Filter Tips | StemCellTM Technologies | 20125 | |
| SepMateTM-50 (IVD) tubes | StemCellTM Technologies | 85460 | IVD – In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes |
| Vi-CELL XR Cell Anlayzer | Beckman Coulter Life Sciences | Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196). | |
| Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit | Beckman Coulter Life Sciences | 383722 |
References
- Alexovic, M., et al. Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications. Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).
- Zhang, M., Huang, B. The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells. Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).
- Kleeberger, C. A., et al. Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).
- Gautam, A., et al. Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods. PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).
- Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells. Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).
- Coppola, L., et al. Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation. J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).
- Stemcell Technologies. . 27156, (2020).
- Hornschuh, M., et al. Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes. Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).
- Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour. F1000Res. 6, 2045 (2017).
- Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage. Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).
- Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Available from: https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html (2022)
- . Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use Available from: https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf (2017)
- Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).
- Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. . Histology, white blood cell. , (2024).
- Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study. Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).
- Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
- Yi, P. C., et al. Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays. J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).
- Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function. J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society. Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).
.