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Biology

Isolement de cellules mononucléées de sang périphérique humain à partir de couches leucocytaires par séparation immunomagnétique à haut débit

Published: July 19, 2024
doi:
10.3791/66887
, , ,
1New South Wales Health Statewide Biobank,New South Wales Health Pathology

Summary

Ce protocole détaille une méthode compatible avec l’automatisation à haut débit pour isoler les cellules mononucléées du sang périphérique humain à des fins de biobanque et à d’autres fins.

Abstract

Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont une population hétérogène de monocytes et de lymphocytes. Les PBMC cryoconservés ont une viabilité stable en stockage à long terme, ce qui en fait un type de cellule idéal pour de nombreuses recherches en aval, notamment la cytométrie en flux, les immunoessais et le séquençage du génome. En règle générale, les PBMC sont isolés par centrifugation à gradient de densité, mais il s’agit d’un flux de travail à faible débit qui est difficile et coûteux à mettre à l’échelle. Cet article présente un flux de travail à haut débit utilisant une méthode d’isolation PBMC basée sur des billes magnétiques qui est rapide à mettre en œuvre. La concentration cellulaire totale, la viabilité et la distribution de la population avec les PBMC obtenues à l’aide de l’isolement par gradient de densité ont été comparées, et la viabilité cellulaire et la proportion de types cellulaires étaient comparables pour les deux techniques. Les PBMC isolés ont démontré une viabilité de plus de 70 % jusqu’à 9 jours après le prélèvement sanguin, bien que le rendement ait diminué de moitié après 5 jours par rapport aux PBMC traités dans les 24 heures suivant le prélèvement. En résumé, cet article décrit un protocole PBMC qui utilise une approche basée sur les billes pour s’adapter à un flux de travail à haut débit et démontre que les méthodes manuelles et automatisées basées sur les billes peuvent augmenter la capacité de traitement et offrir une flexibilité pour différents budgets.

Introduction

L’isolement de cellules mononucléées dans le sang périphérique (PBMC) est une technique qui permet de séparer et d’isoler les lymphocytes et les monocytes des autres constituants du sang total. Les PBMC sont un type de cellule polyvalent utilisé pour de nombreuses applications, y compris, mais sans s’y limiter, l’immunothérapie, le développement de vaccins, l’identification de cibles ou de biomarqueurs, et le développement de médicaments anticorps/petites molécules 1,2. Ces cellules peuvent être isolées d’individus sains ou malades et peuvent être utilisées immédiatement dans des processus en aval ou cryoconservées pour des recherches futures3. Dans certains cas, l’objectif en aval est connu, tandis que dans d’autres, comme c’est souvent le cas dans les biobanques, les PBMC sont isolés et stockés pour de futures applications non spécifiées4.

La centrifugation par gradient de densité est la technique traditionnelle pour isoler les PBMC 5,6,7 du sang total, en utilisant la séparation différentielle des types de cellules constitutives en fonction de la densité cellulaire pendant la centrifugation. Bien qu’il puisse y avoir certaines variations dans cette méthode, le sang total est généralement dilué avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), superposé sur un milieu à gradient de densité dans un tube de centrifugation spécialisé ou standard, puis essoré. Il en résulte quatre couches distinctes : la couche supérieure de plasma est enrichie de plaquettes, une fine couche de PBMC se trouve au-dessus du milieu de gradient de densité, et enfin, la couche inférieure est constituée de globules rouges (GR) et de granulocytes. Bien que cette méthode ait déjà été qualifiée de « référence »8, la mise à l’échelle présente des limites, telles que le temps de traitement long, la capacité de centrifugation, la difficulté d’aliquoter d’autres produits sanguins (c’est-à-dire le plasma et les globules rouges) et la lenteur de l’automatisation. Bien que l’automatisation soit possible pour cette méthode9, elle nécessite une programmation complète d’un manipulateur de liquides (avec un module de centrifugation entièrement automatisé) et reste un processus long.

Désormais, un flux de travail alternatif qui utilise la séparation immunomagnétique des billes avec soit un aimant à huit supports pour le traitement manuel, soit un instrument pour un traitement entièrement automatisé est présenté. Cette méthode utilise un cocktail d’anticorps qui est ajouté aux cellules et se lie aux populations cellulaires indésirables, dans ce cas, les plaquettes, les granulocytes et les globules rouges. Ces populations indésirables sont ensuite éliminées par séparation magnétique, laissant les populations de monocytes et de lymphocytes dans la fraction négative qui sont prêtes pour le traitement en aval10. Cette méthode de sélection négative est plus rapide que les méthodes de sélection positive, qui nécessitent des étapes supplémentaires pour éliminer le complexe d’anticorps et de billes magnétiques des PBMC. La sélection négative est également avantageuse, car elle a été décrite comme un moyen de préserver la fonctionnalité cellulaire11,12.

Protocol

Les échantillons de sang de contrôle de la qualité et les données générées à l’interne (telles que le nombre de cellules, la viabilité et l’âge de l’échantillon au moment du traitement) ont été obtenus à partir d’études de recherche consenties à la NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (approbation HREC : 2019/ETH06776). Des échantillons de sang humain adulte traités (c.-à-d. appauvris en plasma), non filtrés et anonymisés ont été prélevés dans des tubes EDTA. Ces échantillons de sang de contrôle de la qualité ont été traités moins de 72 heures après le prélèvement et ont été utilisés pour des expériences d’isolement PBMC comparant les méthodes basées sur le gradient de densité et les billes. Pour la méthode de séparation par gradient de densité utilisée dans les résultats représentatifs, voir la procédure dans le fichier supplémentaire 1. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés pour cette étude sont énumérés dans la table des matériaux. 1. Préparation du sang total Retournez doucement des tubes de sang entier de 10 ml (enrobés d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA], d’acide-citrate-dextrose [ACD] ou d’héparine de lithium) 10 fois à température ambiante. Facultatif : Si du sang total doit être stocké, aliquote dans des cryotubes pour un stockage à -80 °C. Centrifuger les tubes à l’aide d’un rotor à godet oscillant à 800 x g pendant 10 min à 22 °C avec le frein activé (9 accélération/ 9 décélération). 2. Collection de manteaux leucocytaires Après la centrifugation, placez les échantillons dans une enceinte de sécurité biologique et vérifiez la présence des trois couches distinctes (comme le montre la figure 1).REMARQUE : Les globules rouges se trouvent dans la couche inférieure rouge foncé du tube de centrifugation. Une couche blanche opaque contenant des globules blancs et des plaquettes est située au-dessus de la couche de globules rouges, connue sous le nom de couche leucocytaire. La couche supérieure jaune contient du plasma. Facultatif : Si le plasma doit être stocké, aliquote le plasma dans des cryotubes pour un stockage à -80 °C. Pipeter 1 mL de couche leucocytaire (matière première) à partir d’un tube de sang de 10 mL et transférer dans le tube spécifié et étiqueté à l’étape 3.1 et à l’étape 4.1 pour les méthodes manuelle et automatisée, respectivement. Faites tourbillonner la couche leucocytaire (couche blanche opaque) à l’aide de la pointe de la pipette et prélevez la couche leucarcocytaire en aspirant.REMARQUE : Moins de 100 μL de plasma et de globules rouges sont acceptables pendant l’aspiration. Si plusieurs tubes de sang sont prélevés pour un participant, les couches leucocytaires peuvent être regroupées ; Cependant, cela peut affecter la concentration plaquettaire13. Pour le traitement manuel, passez à la section 3. Pour le traitement automatisé, passez à la section 4. Facultatif : Si les globules rouges doivent être stockés, aliquotez-les dans des cryotubes pour un stockage à -80 °C. 3. Purification PBMC – Méthode manuelle REMARQUE : Jusqu’à 8 échantillons par support d’aimant peuvent être traités par un seul opérateur. Étiquette 3 tubes en polystyrène de 5 mL avec les lettres A-C.REMARQUE : Utilisez la numérotation séquentielle si vous effectuez plus d’un échantillon, c’est-à-dire 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C. Ajouter 60 μL d’EDTA 0,1 M (pour une concentration finale d’EDTA de 6 mM, pH 8,0, voir la fiche supplémentaire 2 pour la recette) dans le tube A contenant la couche leucocytaire transférée à l’étape 2.3. Ajouter 50 μL du tube de mélange cocktail (voir le tableau des matériaux) dans le tube A, mélanger en pipetant de haut en bas au moins 3 fois et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 890 μL de PBS dans le tube A et mélanger en pipetant de haut en bas au moins 3 fois. Vortex le tube à billes magnétiques (voir Tableau des matériaux) pendant 30 s. Ajouter 50 μL de billes magnétiques dans le tube A et mélanger en pipetant de haut en bas au moins 3 fois. Placez immédiatement le tube A dans le support magnétique et incubez pendant 5 min à température ambiante. Pipetez soigneusement la suspension cellulaire enrichie dans le tube B, en prélevant la fraction claire avec des globules rouges nus/minimaux (<100 μL) pour une récupération optimale des PBMC.REMARQUE : Ne dérangez pas les perles liées à l’aimant. Une pipette de transfert est recommandée. Retirez le tube A du support magnétique et jetez-le. Ajouter des billes magnétiques de 50 μL à la suspension cellulaire dans le tube B et mélanger en pipetant de haut en bas au moins 3 fois. Placez immédiatement le tube B dans le support magnétique et incubez pendant 5 min à température ambiante. Pipetez soigneusement la suspension cellulaire enrichie dans le tube C, en ne recueillant que la fraction claire.REMARQUE : Ne dérangez pas les perles liées à l’aimant. Une pipette de transfert est recommandée. Retirez le tube B du support magnétique et jetez-le. Placez immédiatement le tube C dans le support magnétique et incubez pendant 5 min à température ambiante. Pipetez soigneusement la suspension cellulaire enrichie dans un tube à centrifuger étiqueté et complétez jusqu’à 2 ml avec du PBS. Transférez 50 μL de la suspension cellulaire dans un gobelet d’échantillon du compteur de cellules automatisé. Pour une dilution de 1:10, ajoutez 450 μL de PBS. Passez à la section 5 pour les étapes de comptage des cellules. 4. Purification PBMC – Méthode automatisée REMARQUE : Jusqu’à 4 échantillons peuvent être traités par un seul instrument PBMC automatisé. Plusieurs instruments peuvent être exécutés en parallèle par un seul opérateur. Étiquetez 2 tubes de 14 mL avec les lettres A et B, 1 tube à centrifuger de 50 mL avec la lettre C et 1 tube à centrifuger de 50 mL avec « déchets ».REMARQUE : Un seul conteneur à déchets est requis pour chaque passage sur l’instrument PBMC automatisé. Utilisez la numérotation séquentielle si vous effectuez plus d’un échantillon, c’est-à-dire 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C. Ajouter 60 μL d’EDTA 0,1 M (pour une concentration finale d’EDTA de 6 mM) dans le tube A contenant la couche leucocytaire transférée à l’étape 2.3. Vortex le tube à billes magnétiques (voir Tableau des matériaux)  pendant 30 s. Allumez l’instrument PBMC automatisé en le mettant sous tension à l’avant de l’instrument. Sur l’écran d’accueil de l’instrument PBMC automatisé, sélectionnez le profil et le protocole souhaité.REMARQUE : L’isolement PBMC humain EasySep Direct 19654 – couche leucocytaire était le profil de protocole sélectionné pour cette isolation PBMC. Voir la procédure standard du fabricant pour ce profil dans le rapport de protocole14. Entrez le volume de départ (la quantité de couche leucocytaire aspirée dans le tube A) et répétez l’opération pour chaque échantillon. Sélectionnez tous les quadrants qui utiliseront le même kit de réactifs.REMARQUE : Si le même protocole est utilisé pour plus d’un quadrant, l’instrument PBMC automatisé suggérera d’utiliser le même kit de réactifs pour tous les quadrants14. Chargez le carrousel de l’instrument avec des consommables étiquetés, des pointes de filtre et un récipient tampon. Le kit de réactifs contenant le tube à billes magnétiques et le tube de mélange cocktail doit être chargé dans le quadrant 1.REMARQUE : L’instrument demandera à l’utilisateur si l’utilisateur souhaite utiliser 1 kit de réactifs pour tous les quadrants. Sélectionnez « oui » et mettez en surbrillance tous les quadrants à l’aide du kit de réactifs. Une fois le chargement terminé, retirez les couvercles des consommables et des réactifs et sélectionnez Exécuter sur l’écran de l’instrument. Une fois l’essai terminé, sélectionnez, déchargez et retirez les échantillons (contenant la suspension PBMC étiquetée dans le tube C) du carrousel de l’instrument. Rangez le tube à billes magnétiques, le tube de mélange à cocktail et le récipient tampon à 4 °C. Jetez les tubes étiquetés A, B et les déchets (voir étape 4.1) et les pointes filtrantes.REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de faire l’appoint avec du PBS pour la méthode automatisée, car la suspension PBMC produit un volume final de 7 ml. Transférez 500 μL des cellules dans un gobelet d’échantillon pour une numération cellulaire sans dilution. Passez à la section 5 pour le comptage des cellules. 5. Comptage des cellules Effectuer le comptage et la viabilité des cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan en suivant les instructions du fabricant15.REMARQUE : Pour les processus internes de l’auteur, l’analyse des cellules est effectuée à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avec les paramètres suivants pour acquérir les PBMC.Facteur de dilution = 10 (pour le protocole manuel, si la suspension cellulaire est dans un faible volume) ou 1 (pour le protocole automatisé)Type de cellule : PBMCPlage de concentration = 5 x 104 à 1 x 107 cellules/mLGamme de tailles (diamètre) = 8 μm à 50 μmNombre d’images = 50 6. Préparation de la cryoconservation Centrifuger (à l’aide d’un rotor à godets oscillants) les tubes d’échantillon à 300 x g pendant 8 min à 22 °C avec le frein activé (9 accélération/ 9 décélération). Après la centrifugation, replacez les échantillons dans l’enceinte de sécurité biologique. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement le surnageant. Une petite quantité de surnageant peut être laissée avec la pastille PBMC pour s’assurer qu’elle n’est pas dérangée. Remettre la pastille en suspension dans 3 mL de milieu de cryoconservation froid. Mélangez lentement et doucement la suspension de haut en bas jusqu’à ce qu’elle soit homogène.REMARQUE : Le volume du milieu de cyroconservation peut être ajusté en fonction de la concentration finale souhaitée de PBMC. Versez 1 mL de PBMC remis en suspension dans un cryotube pré-assigné et placez-le dans un récipient de congélation à taux contrôlé pendant au moins 4 h à -80 °C.REMARQUE : Le volume de PBMC aliquote sur chaque cryotube peut être ajusté en fonction de la préférence de l’investigateur. Après avoir stocké les cryotubes à -80 °C pendant au moins 4 h, transférez les cryotubes dans un réservoir en phase vapeur d’azote liquide pour un stockage à long terme. 7. Analyse statistique des données Les données représentatives des résultats ont été analysées à l’aide d’un logiciel statistique et graphique, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 3.

Representative Results

Les proportions de lymphocytes, de monocytes, de neutrophiles, d’éosinophiles et de basophiles avant (c.-à-d. dans le sang total) et après l’isolement des PBMC ont été mesurées lorsque les PBMC ont été isolés à l’aide de la méthode de séparation à base de billes ou de gradient de densité. Les proportions de lymphocytes et de monocytes ont été significativement enrichies par les deux méthodes (Figure 2A,B). De plus, les proportions de neutrophiles, d’éosinophiles et de basophiles (c.-à-d. les granulocytes) ont diminué de façon significative dans les PBMC isolés par la méthode à base de billes (figure 2C-F). Il n’y avait pas de différences significatives dans les proportions de lymphocytes, de monocytes, de neutrophiles, d’éosinophiles, de basophiles et de granulocytes entre les méthodes à gradient de densité et les méthodes basées sur les billes (figure 2). Le pourcentage de récupération a également été calculé pour les types de cellules énumérés ci-dessus (voir la figure supplémentaire 1). La viabilité cellulaire moyenne était supérieure à 95 % pour les deux méthodes et n’était pas significativement différente (figure 3A). Les PBMC ont également été dénombrés à l’aide d’une gamme de tailles (diamètre) de 8 μm à 50 μm, où la méthode de séparation par gradient de densité a produit un nombre total de cellules environ deux fois plus élevé (figure 3B). Ensuite, la méthode automatisée à base de billes a été comparée à la méthode manuelle. Aucune différence significative n’a été relevée pour la viabilité cellulaire (figure 4A) ou le nombre total de cellules (figure 4B) à l’aide de la méthode manuelle ou automatisée. Le temps de traitement de ces 8 échantillons a été comparé, y compris le temps de non-intervention ne nécessitant aucune intervention humaine. Le temps de traitement total de 8 échantillons était de 43 min vs. 57 min pour le manuel vs. la méthode automatisée. La méthode automatisée comprenait 35 minutes de traitement sans intervention (figure 4C). Le flux de travail basé sur des billes d’isolement PBMC (avec aliquotage du sang total et du plasma) a été testé pendant 9 mois, au cours duquel 1410 échantillons PBMC ont été isolés à partir de sang humain non testé à l’aide de la plateforme manuelle pour les 820 premiers participants, puis à l’aide de la méthode automatisée pour les 590 participants suivants. Le traitement a été effectué le même jour ou jusqu’à 10 jours après le prélèvement, conformément aux critères d’acceptation de l’étude, les retards de traitement étant principalement attribuables aux temps de transit des échantillons. Avec la méthode manuelle ou automatisée, les PBMC traités dans les 24 heures suivant la collecte présentaient la viabilité et le taux de récupération les plus élevés (figure 5). La viabilité cellulaire moyenne était de >90 % pour les PBMC traités dans les 5 jours et de >70 % pour les PBMC traités dans les 10 jours (figure 5A). Les rendements moyens en PBMC ont diminué de 50 % après 5 jours par rapport aux échantillons traités dans les 24 heures (Figure 5B). Figure 1 : Flux de travail schématique du protocole d’isolation PBMC basé sur des billes à partir de la couche leucocytaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Proportions de lymphocytes, de monocytes, de neutrophiles, d’éosinophiles, de basophiles et de granulocytes dans le sang total avant et après l’isolement PBMC par gradient de densité et méthodes basées sur des billes. Pourcentage de lymphocytes (A), de monocytes (B), de neutrophiles (C), d’éosinophiles (D), de basophiles (E) et de granulocytes (F) dans le sang total apparié avant l’isolement PBMC (carrés) et dans les PBMC après l’isolement via la méthode du gradient de densité (cercles ouverts) ou basée sur des billes (cercles fermés) (n = 8). ns = non significatif, et *p < 0,05 déterminé par l’ANOVA à un facteur (A et B) ou le test de Friedman (C- F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Viabilité et numération cellulaire totale de PBMC isolés par des méthodes basées sur le gradient de densité et les billes. (A) Viabilité cellulaire moyenne (± ET) des échantillons traités à l’aide d’un gradient de densité (carrés, barre sombre) vs. Méthodes basées sur des billes (cercles, barre ouverte) pour 8 échantillons appariés. ns = non significatif par test t apparié. (B) Nombre total de cellules pour les échantillons traités à l’aide du gradient de densité (carrés, barre sombre) vs. Méthodes basées sur des billes (cercles, barre ouverte) pour 8 échantillons appariés. *p < 0,05 déterminé à l’aide d’un test t apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Comparaison des méthodes manuelles et automatisées basées sur des billes. (A) Viabilité cellulaire moyenne (± ET) pour les échantillons traités manuellement (carrés, barres foncées) vs. Méthodes automatisées (cercles, barre ouverte) basées sur des billes pour 8 échantillons appariés. ns = non significatif selon le test de Mann-Whitney. (B) Nombre total de cellules pour les échantillons traités manuellement (carrés) vs. Méthodes automatisées (cercles) basées sur des billes pour 8 échantillons appariés. ns = non significatif par test t apparié. (C) Temps de traitement pour 8 échantillons traités à l’aide d’un système manuel vs. méthodes automatisées, y compris les périodes de manipulation (barre lumineuse) et de non-intervention (barre sombre). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Viabilité et rendement des PBMC isolés à partir de la méthode à base de billes, manuellement ou à l’aide de l’automatisation en fonction du temps entre le prélèvement de l’échantillon et le stockage des PBMC. (A) Viabilité cellulaire moyenne (± IC à 95 %) pour les échantillons de participants traités manuellement (barre noire) vs. méthodes automatisées (open bar) basées sur des billes. Tableau détaillant le nombre de participants. ns = non significatif. S.O. = Sans objet. *p < 0,05 par le test de comparaison multiple de Tukey. (B) Nombre total de cellules pour les échantillons de participants traités manuellement (barre sombre) vs. méthodes automatisées (open bar) basées sur des billes. Tableau détaillant le nombre de participants. ns = non significatif. S.O. = Sans objet. *p < 0,05 par le test de comparaison multiple de Tukey. Aucune valeur pour le jour 10 automatisé en raison du nombre de réplications inférieur à 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure supplémentaire 1 : Figure du pourcentage de récupération différentielle des cellules avec les méthodes du gradient de densité et des billes. Le pourcentage a été calculé à l’aide de la numération cellulaire absolue avant l’isolement dans le sang total et après la suspension cellulaire après l’isolement à l’aide de la méthode du gradient de densité (carrés, barre foncée) et de la méthode basée sur les billes (cercles, barre ouverte) (n = 8). ns = non significatif, et *p < 0,05 tel que déterminé par le test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 1 : Protocole de gradient de densité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Dossier supplémentaire 2 : Préparation de 0,1 M d’EDTA, pH 8,0 dans du PBS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 3 : Procédures détaillées effectuées pour générer les données représentatives. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les PBMC humains sont des types de cellules polyvalents utilisés pour de nombreux essais ; Cependant, le débit d’isolement est souvent une limitation dans de nombreux laboratoires, y compris les biobanques16. Auparavant, la NSW Health Statewide Biobank isolait les PBMC à l’aide de la méthode du gradient de densité. L’automatisation a été étudiée pour la méthode de séparation par gradient de densité afin d’augmenter la capacité de traitement, mais des obstacles à la mise en œuvre ont été identifiés, notamment (i) le coût d’un manipulateur de liquides avec une unité de centrifugation entièrement automatisée, avec l’exigence supplémentaire d’une unité HEPA pour produire un produit stérile, (ii) du personnel formé pour la programmation et (iii) le temps requis pour les tests de protocole. Par conséquent, cette étude a exploré d’autres méthodes et a identifié le kit PBMC humain obtenu commercialement qui pourrait être utilisé pour le traitement manuel et automatisé. La stérilité est assurée car l’équipement nécessaire au traitement s’insère dans une enceinte de sécurité biologique standard (longueur de 1,2 m). Ce document détaille les modifications apportées au protocole14 recommandé par le fabricant, afin d’augmenter l’efficacité et de réduire les coûts des réactifs sans sacrifier la qualité. De plus, le protocole du fabricant a été élargi pour détailler les étapes de la biobanque d’échantillons pour des recherches futures, y compris l’aliquotage du sang total (étape 1.2), du plasma (étape 2.2) et des globules rouges (étape 2.5) à partir du tube sanguin d’origine, ainsi que le comptage et la cryoconservation des cellules.

Dans cette étude, trois protocoles d’isolation PBMC ont été comparés : la séparation par gradient de densité, l’isolation manuelle et l’isolation automatisée à base de billes. Des modifications ont été apportées au protocole manuel du fabricant basé sur les billes, y compris l’élimination de la dilution de la couche leucocytaire avant l’isolement du PBMC et l’élimination de l’exigence de rupture pour les centrifugations, permettant aux enquêteurs de suivre un protocole d’isolement PBMC adaptable, rentable et à haut débit. Tout d’abord, huit échantillons de sang total appariés ont été utilisés pour isoler les PBMC afin de comparer la séparation par gradient de densité et la technique manuelle basée sur des billes. Il est important de noter que la distribution des populations cellulaires, la viabilité cellulaire et la récupération des PBMC n’étaient pas significativement différentes entre les deux méthodes comparées, comme le montrent respectivement les figures 2A-F, 3A et 1 supplémentaire. Dans les données représentatives, le nombre de cellules était plus élevé pour la méthode de séparation par gradient de densité utilisant la méthode d’exclusion du bleu de trypan, mais pas lorsqu’un analyseur de cellules hématologiques a été utilisé. Les paramètres de type de cellule PBMC sur le compteur de cellules utilisaient une plage de diamètre de cellule de 8 à 50 μm et, par conséquent, les comptages incluront les PBMC ainsi que les granulocytes (environ 12 à 15 μm de diamètre) lors de l’utilisation de la méthode d’exclusion du bleu de trypan17. Bien que le compteur de cellules hématologiques ait offert une spécificité plus élevée que la méthode d’exclusion du bleu de trypan, certains calculs de récupération étaient supérieurs à 100 %, reflétant la marge d’erreur de l’instrument (voir la figure supplémentaire 1). Il est donc recommandé aux chercheurs d’appliquer une combinaison de techniques de comptage cellulaire lorsqu’ils comparent les rendements des protocoles d’isolement PBMC, car la plupart des techniques n’offrent pas à la fois des numérations cellulaires différentielles spécifiques et très sensibles. De plus, aucun test n’a été effectué pour comparer l’activité fonctionnelle des PBMC obtenue par l’une ou l’autre technique, ce qui constitue une limite de notre analyse.

Ensuite, les méthodes manuelles et automatisées à base de billes ont été comparées, et aucune différence significative entre le rendement ou la viabilité des PBMC n’a été identifiée à partir de 8 échantillons appariés (figures 4A, B). Les populations cellulaires n’ont pas été comparées individuellement, car le même cocktail d’isolement d’anticorps a été utilisé pour les deux méthodes. Il est important de noter que le temps de manipulation nécessaire au traitement de 8 échantillons a été réduit de 43 min à 22 min à l’aide du protocole automatisé (figure 4C). Alors que le débit, la prévention de l’épuisement des techniciens et la cohérence du traitement des échantillons sont assurés grâce à l’automatisation, le coût des réactifs et des consommables est nettement plus élevé, soit 3 à 4 fois plus élevé que la méthode manuelle à base de billes. Ceci après avoir apporté des modifications au protocole du fabricant pour utiliser 1 mL de couche leucocytaire (à partir d’un volume de sang total de 10 mL) au lieu de la plage recommandée de 2 à 5 mL (à partir d’un volume de sang total de 10 mL et/ou plus). Si le budget est une limite, opter pour la méthode manuelle permet de réduire le temps de traitement de ~25% tout en maintenant des coûts de réactifs et de consommables comparables à ceux de la méthode de séparation par densité. Il est recommandé de ne pas traiter plus de 8 échantillons à la fois par technicien afin d’assurer un échelonnement adéquat des échantillons (~30 s/échantillon) pendant les périodes d’incubation de 5 minutes (étapes 3.7, 3.11 et 3.14).

Dans les méthodes manuelles et automatisées à base de billes, l’élimination de la couche leucocytaire est une étape essentielle pour assurer une isolation optimale des PBMC. Il est important de noter qu’une couche leucalaire plutôt que du sang total est utilisée dans ce protocole car le volume des réactifs est basé sur les volumes de matière première10. Enlever efficacement tout le volume de la couche leucocytaire peut être techniquement difficile. Initialement, cette méthode consistait à enlever 0,5 ml de couche leucocytaire, mais elle a été augmentée à 1 ml pour améliorer la récupération. Pour assurer une récupération adéquate et uniforme de la couche leucocytaire, il est important de détailler ce processus dans la documentation du protocole et la formation. Il est recommandé de faire tourner une pointe de pipette tout en aspirant la couche leucocytaire en prenant soin de ne pas aspirer trop de globules rouges de la couche inférieure (étape 2.3). Il est important de ne pas saturer le cocktail d’anticorps qui lie les cellules indésirables (c’est-à-dire les granulocytes et les globules rouges), ce qui peut avoir un impact sur le rendement et la pureté10. Pour minimiser les globules rouges collectés lors de l’extraction de la couche leucocytaire, l’extrémité de la pipette doit se trouver entre la couche de plasma et la couche leucocytaire. Le volume de la couche leucocytaire peut être augmenté à partir de 1 mL ; cependant, il faut prendre des précautions comme décrit ci-dessus pour s’assurer que pas plus de 10 % du volume recueilli contient des globules rouges. Alternativement, un manipulateur de liquide automatisé peut être utilisé pour collecter les couches leucocytaires de manière constante18. Cependant, les heures consacrées à l’étalonnage et au dépannage des protocoles des instruments de manipulation des liquides, surtout compte tenu des coûts, peuvent ne pas être réalisables pour la plupart des laboratoires.

La transition et l’application du protocole d’automatisation basé sur des billes étaient essentielles compte tenu de l’objectif de la NSW Health Statewide Biobank de traiter 23 000 PBMC au cours des 3 prochaines années. Ici, il a été démontré que les PBMC peuvent être isolés des sondes ACD jusqu’à 9 jours après le prélèvement avec une viabilité moyenne >70%. Bien que les rendements aient été optimaux 24 heures après la collecte, le traitement dans ce délai n’est pas toujours réalisable car les échantillons peuvent devoir être transportés. Il a été démontré que les PBMC isolés à l’aide de la méthode manuelle ou automatisée à base de billes peuvent avoir des rendements de >3 x 105 cellules/mL de sang total lorsqu’ils sont isolés dans les 4 jours suivant le prélèvement et de >1 x 105 cellules/mL de sang total lorsqu’ils sont isolés dans les 10 jours suivant le prélèvement. Le faible nombre d’échantillons sur 5 jours est considéré comme une limite de cette analyse. De plus, les données n’ont pas été séparées en fonction de l’âge, du sexe et des antécédents cliniques des participants, car ces informations n’ont pas été rendues disponibles. Bien qu’une analyse comparative soit nécessaire pour examiner les effets des retards dans les délais de traitement des deux méthodes, il a déjà été signalé que les retards dans l’isolement des PBMC à l’aide de la méthode du gradient de densité diminuent la qualité des cellules et augmentent considérablement la contamination par les globules rouges19,20. De plus, les proportions de granulocytes augmentent si le traitement est retardé et, par conséquent, les échantillons d’âges similaires doivent être regroupés pour les analyses en aval 20,21,22. Il convient de noter que cette expérience a été réalisée à l’aide de sang anticoagulé avec du dextrose citrique acide (c’est-à-dire du citrate trisodique, de l’acide citrique et du dextrose) ; cependant, le rendement et/ou la proportion de types de cellules peuvent varier si d’autres anticoagulants sont utilisés23 ; par conséquent, il est conseillé aux chercheurs de choisir un anticoagulant approprié en fonction des analyses PBMC prévues en aval.

En résumé, un protocole d’isolation PBMC à l’aide de billes magnétiques adaptable aux flux de travail à haut débit est détaillé pour répondre aux exigences de mise à l’échelle sans compromettre la viabilité des cellules. Les méthodes manuelles et automatisées peuvent être optimisées pour produire des concentrations de cellules spécifiques en modifiant les volumes de démarrage et de remise en suspension. La NSW Health Statewide Biobank est passée de l’extraction de ~60 PBMC par mois à l’aide de la technique traditionnelle de séparation par gradient de densité à ~300 PBMC par mois à l’aide de cette méthode basée sur des billes compatible avec l’automatisation. Le prochain objectif des auteurs est d’utiliser la plateforme automatisée pour traiter jusqu’à 1200 PBMC par mois et de comparer davantage les PBMC isolés à la fois par des techniques à base de billes magnétiques (manuelles et automatisées) et à gradient de densité afin de guider la mise en œuvre de cette technique vers d’autres laboratoires, avec un accent particulier sur les biobanques.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La NSW Health Statewide Biobank remercie le soutien de NSW Health Pathology, du NSW Office for Health and Medical Research et du Sydney Local Health District. De plus, les auteurs remercient Omico et d’autres études de recherche soutenues par la NSW Health Statewide Biobank d’avoir accordé l’autorisation de publier des données générées en interne et d’utiliser des échantillons inutilisés à des fins de recherche. Les auteurs remercient la professeure Jennifer Bryne (NSW Health Pathology, Université de Sydney) pour son leadership critique et ses discussions. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Materials

Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR) StemCellTM Technologies 07930
Class II Biological Safety Cabinet Thermo ScientififcTM 51033311
CoolCell 1 mL FX BioTools BCS-407P This is the control rate freezing container used.
Distilled Water  Bacto Laboratories 561832
DxH 500 Hematology Analyzer  Beckman Coulter Life Sciences B40601 Referred to as external automated cell counter.
EasyEightsTM EasySepTM Magnet StemCellTM Technologies 18103
EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit StemCellTM Technologies 19654 Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich Pty Ltd E6758-500G Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2.
LymphoprepTM Density Gradient Medium StemCellTM Technologies 7851
Megafuge ST4 Plus Centrifuge Thermo ScientififcTM THR75009903
Orion Star A211 pH meter electrode Thermo ScientififcTM STARA2110
Orion™ ROSS Ultra™ Glass Triode™ pH/ATC Combination Electrodes Thermo ScientififcTM 8302BNURCA
Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml Life Technologies Australia Pty Ltd 10010023
Prism GraphPad
RoboSepTM Buffer 1X StemCellTM Technologies 20104 Software used for statistical analysis.
RoboSepTM-S StemCellTM Technologies 21000 Fully automated cell separator instrument.
RoboSep™ Filter Tips StemCellTM Technologies 20125
SepMateTM-50 (IVD) tubes StemCellTM Technologies 85460 IVD – In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes
Vi-CELL XR Cell Anlayzer Beckman Coulter Life Sciences Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196).
Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit Beckman Coulter Life Sciences 383722
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Villalva, M., Macphail, S., Li, Y., Caruana, B. Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation. J. Vis. Exp. (209), e66887, doi:10.3791/66887 (2024).
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