Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Menselijke PBMC’s zijn veelzijdige celtypen die worden gebruikt voor tal van tests; De doorvoer van isolatie is echter vaak een beperking in veel laboratoria, waaronder biobanken¹⁶. Voorheen isoleerde de NSW Health Statewide Biobank PBMC’s met behulp van de dichtheidsgradiëntmethode. Automatisering werd onderzocht voor de dichtheidsgradiëntscheidingsmethode om de verwerkingscapaciteit te vergroten, maar er werden belemmeringen voor de implementatie geïdentificeerd, waaronder (i) de kosten van een vloeistofverwerker met een centrifugatie-eenheid die volledig geautomatiseerd moet zijn, met de extra vereiste voor een HEPA-eenheid om een steriel product te produceren, (ii) opgeleid personeel voor programmering, en (iii) tijd die nodig is voor protocoltesten. Daarom werden in deze studie alternatieve methoden onderzocht en werd de commercieel verkregen humane PBMC-kit geïdentificeerd die kan worden gebruikt voor handmatige en geautomatiseerde verwerking. Steriliteit is gegarandeerd omdat de apparatuur die nodig is voor de verwerking past in een standaard (lengte van 1,2 m) biologische veiligheidskast. Dit document beschrijft de wijzigingen die zijn aangebracht in het door de fabrikant aanbevolen protocol¹⁴ om de efficiëntie te verhogen en de reagenskosten te verlagen zonder dat dit ten koste gaat van de kwaliteit. Bovendien werd het protocol van de fabrikant uitgebreid met gedetailleerde stappen voor biobankmonsters voor toekomstig onderzoek, waaronder volbloed (stap 1.2), plasma (stap 2.2) en RBC (stap 2.5) aliquotering van de originele bloedbuis, evenals celtelling en cryopreservatie.

In deze studie werden drie PBMC-isolatieprotocollen vergeleken: dichtheidsgradiëntscheiding, handmatige en geautomatiseerde isolatie op basis van kralen. Er werden wijzigingen aangebracht in het handmatige protocol van de fabrikant op basis van kralen, waaronder het verwijderen van de verdunning van de buffycoat voorafgaand aan PBMC-isolatie en het elimineren van de vereiste voor afbreken voor centrifugaties, waardoor onderzoekers een aanpasbaar, kosteneffectief en high-throughput PBMC-isolatieprotocol kunnen volgen. Eerst werden acht gematchte volbloedmonsters gebruikt om PBMC’s te isoleren om de scheiding van de dichtheidsgradiënt en de handmatige op kralen gebaseerde techniek te vergelijken. Belangrijk is dat de verdeling van de celpopulatie, de levensvatbaarheid van de cellen en het herstel van PBMC’s niet significant verschilden tussen de twee vergeleken methoden, zoals weergegeven in respectievelijk figuur 2A-F, figuur 3A en aanvullende figuur 1. In de representatieve gegevens waren het aantal cellen hoger voor de dichtheidsgradiëntscheidingsmethode met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode, maar niet wanneer een hematologiecelanalysator werd gebruikt. De PBMC-celtype-instellingen op de celteller gebruikten een celdiameterbereik van 8-50 μm, en daarom zullen tellingen zowel PBMC’s als granulocyten (ongeveer 12-15 μm in diameter) omvatten bij gebruik van de trypanblauwe uitsluitingsmethode¹⁷. Hoewel de hematologische celteller een hogere specificiteit bood dan de trypanblauwe uitsluitingsmethode, waren sommige herstelberekeningen hoger dan 100%, wat de foutmarge van het instrument weerspiegelt (zie aanvullende figuur 1). Het wordt daarom aanbevolen dat onderzoekers een combinatie van technieken voor het tellen van cellen toepassen bij het vergelijken van de opbrengsten van PBMC-isolatieprotocollen, aangezien de meeste technieken niet zowel specifieke als zeer gevoelige differentiële celtellingen bieden. Verder werden er geen tests uitgevoerd om de functionele activiteit van PBMC’s van beide technieken te vergelijken, wat een beperking is van onze analyse.

Vervolgens werden de handmatige en geautomatiseerde op kralen gebaseerde methoden vergeleken en werden er geen significante verschillen tussen PBMC-opbrengst of levensvatbaarheid geïdentificeerd uit 8 gematchte monsters (Figuur 4A,B). Celpopulaties werden niet individueel vergeleken, omdat voor beide methoden dezelfde antilichaamisolatiecocktail werd gebruikt. Belangrijk is dat de hands-on tijd om 8 monsters te verwerken werd teruggebracht van 43 minuten naar 22 minuten met behulp van het geautomatiseerde protocol (Figuur 4C). Hoewel de doorvoer, het voorkomen van burn-out door technici en de consistentie van de monsterverwerking worden gegarandeerd met behulp van automatisering, zijn de kosten van reagentia en verbruiksartikelen aanzienlijk hoger, namelijk 3-4 keer meer dan de handmatige methode op basis van kralen. Dit is na het aanbrengen van wijzigingen in het protocol van de fabrikant om 1 ml buffy coat te gebruiken (vanaf een volbloedvolume van 10 ml) in plaats van het aanbevolen bereik van 2-5 ml (vanaf een volbloedvolume van 10 ml en/of groter). Als het budget een beperking is, kan de keuze voor de handmatige methode de verwerkingstijd met ~25% verkorten, terwijl de kosten voor reagentia en verbruiksartikelen vergelijkbaar blijven met die van de dichtheidsscheidingsmethode. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 8 monsters per keer per technicus te verwerken om ervoor te zorgen dat de monsters voldoende worden gespreid (~30 s/monster) binnen de incubatieperioden van 5 minuten (stappen 3.7, 3.11 en 3.14).

Bij zowel de handmatige als de geautomatiseerde op kralen gebaseerde methoden is het verwijderen van de buffy coat een cruciale stap om een optimale PBMC-isolatie te garanderen. Het is belangrijk op te merken dat in dit protocol een buffy coat wordt gebruikt in plaats van volbloed, aangezien het volume van de reagentia is gebaseerd op de volumes van het uitgangsmateriaal¹⁰. Het effectief verwijderen van het volledige volume van de buffy-vacht kan technisch uitdagend zijn. Aanvankelijk werd met deze methode de buffy coat van 0,5 ml verwijderd, maar dit werd verhoogd tot 1 ml om het herstel te verbeteren. Om een adequaat en consistent herstel van de buffy coat te garanderen, is het belangrijk om dit proces in detail te beschrijven in protocoldocumentatie en training. Het wordt aanbevolen om de pipetpunt rond te draaien tijdens het opzuigen van de buffy coat, terwijl u ervoor zorgt dat u niet te veel rode bloedcellen uit de onderliggende laag opzuigt (stap 2.3). Het is belangrijk om de antilichaamcocktail die ongewenste cellen bindt (d.w.z. granulocyten en rode bloedcellen) niet te verzadigen, wat de opbrengst en zuiverheid kan beïnvloeden¹⁰. Om het aantal rode bloedcellen dat tijdens de extractie van de buffycoat wordt verzameld, tot een minimum te beperken, moet de pipetpunt zich tussen het plasma en de buffycoatlaag bevinden. Het volume van de buffy coat kan worden verhoogd vanaf 1 ml; er moet echter voor worden gezorgd zoals hierboven beschreven dat niet meer dan 10% van het verzamelde volume RBC’s bevat. Als alternatief kan een geautomatiseerde vloeistofverwerker worden gebruikt om buffy coats consequent in te zamelen¹⁸. De speciale uren die nodig zijn om instrumentprotocollen voor vloeistofbehandeling te kalibreren en problemen op te lossen, vooral gezien de kosten, zijn echter mogelijk niet haalbaar voor de meeste laboratoria.

De overgang en toepassing van het op automatiseringskralen gebaseerde protocol was essentieel gezien het doel van de NSW Health Statewide Biobank om de komende 3 jaar 23,000 PBMC’s te verwerken. Hier werd aangetoond dat PBMC’s tot 9 dagen na afname kunnen worden geïsoleerd uit ACD-buizen met een gemiddelde levensvatbaarheid >70%. Hoewel de opbrengsten 24 uur na het verzamelen optimaal waren, is verwerking binnen dit tijdsbestek niet altijd haalbaar, omdat de monsters mogelijk moeten worden vervoerd. Er werd aangetoond dat PBMC’s geïsoleerd met de handmatige of geautomatiseerde methode op basis van kralen een opbrengst kunnen hebben van >3 x 10⁵ cellen/ml volbloed wanneer ze binnen 4 dagen na afname worden geïsoleerd en >1 x 10⁵ cellen/ml volbloed wanneer ze binnen 10 dagen na afname worden geïsoleerd. Lage aantallen voor monsters over 5 dagen worden opgemerkt als een beperking van deze analyse. Verder werden de gegevens niet gescheiden op basis van de leeftijden, geslachten en klinische geschiedenis van de deelnemers, aangezien deze informatie niet beschikbaar werd gesteld. Hoewel een vergelijkende analyse nodig is om de effecten van vertragingen in verwerkingstijden voor beide methoden te onderzoeken, is eerder gemeld dat vertragingen in PBMC-isolatie met behulp van de dichtheidsgradiëntmethode de celkwaliteit verminderen en de RBC-besmetting aanzienlijk verhogen^19,20. Bovendien neemt het granulocytenaandeel toe als de verwerking wordt uitgesteld, en daarom moeten monsters van vergelijkbare “leeftijden” worden gegroepeerd voor stroomafwaartse analyses 20,21,22. Merk op dat dit experiment werd uitgevoerd met behulp van bloed dat was gestold met zure citroendextrose (d.w.z. trinatriumcitraat, citroenzuur en dextrose); De opbrengst en/of het aandeel van de celtypen kan echter variëren als andere anticoagulantia worden gebruikt²³; daarom wordt onderzoekers geadviseerd om een geschikt antistollingsmiddel te kiezen op basis van de beoogde stroomafwaartse PBMC-analyses.

Samenvattend is een protocol voor PBMC-isolatie met behulp van magnetische kralen dat kan worden aangepast aan workflows met een hoge doorvoer gedetailleerd om te voldoen aan de vereisten voor schaalvergroting zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen. Zowel de handmatige als de geautomatiseerde methoden kunnen worden geoptimaliseerd om specifieke celconcentraties te produceren door start- en resuspensievolumes te wijzigen. De NSW Health Statewide Biobank is overgestapt van het extraheren van ~60 PBMC’s per maand met behulp van de traditionele dichtheidsgradiëntscheidingstechniek naar ~300 PBMC’s per maand met behulp van deze automatiseringscompatibele op kralen gebaseerde methode. Het volgende doel van de auteurs is om het geautomatiseerde platform te gebruiken om tot 1200 PBMC’s per maand te verwerken en PBMC’s die zijn geïsoleerd door zowel magnetische kralen (handmatig en geautomatiseerd) als dichtheidsgradiënttechnieken verder te vergelijken om de implementatie van deze techniek naar andere laboratoria te begeleiden, met een bijzondere focus op biobanken.