다양한 세포 유형에서 핵체의 동적 변화를 분석하기 위한 다목적 파이프라인
Summary
이 방법은 인간 T 림프구에서 다양한 핵 조직 패턴을 가진 단백질 분포를 평가하기 위한 면역형광 프로토콜 및 정량화 파이프라인을 설명합니다. 이 프로토콜은 시료 전처리부터 시작하여 피지에서 반자동 분석을 실행하는 단계별 지침을 제공하며, Google Colab 노트북을 통한 데이터 처리로 마무리됩니다.
Abstract
전사 제어(transcriptional control)와 같은 다양한 핵 과정은 면역형광 기법을 통해 식별할 수 있는 병소(foci)로 알려진 개별 구조 내에서 발생합니다. 현미경을 통해 다양한 세포 조건에서 이러한 병소의 역학을 조사하면 세포 정체성과 기능을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그러나 다양한 세포 유형에 대해 면역형광 분석을 수행하고 이러한 병소의 조립, 확산 및 분포의 변화를 평가하는 것은 많은 과제를 제시합니다. 이러한 과제에는 시료 전처리, 이미징 데이터 분석을 위한 파라미터 결정, 상당한 양의 데이터 관리의 복잡성이 포함됩니다. 더욱이 기존 이미징 워크플로우는 숙련된 사용자에게 맞춤화된 경우가 많아 더 많은 사용자에 대한 접근성이 제한됩니다.
이 연구에서는 관심 단백질 및 세포 유형에 맞게 맞춤화할 수 있는 다양한 인간 일차 T 세포 유형의 핵 단백질을 조사하기 위해 맞춤화된 최적화된 면역형광 프로토콜을 소개합니다. 또한, 단백질 염색이 뚜렷한 병소를 형성하거나 확산성 핵 분포를 나타내는지 여부에 관계없이 편향되지 않게 정량화하는 방법을 제시합니다.
당사가 제안하는 방법은 자이썬에서 개발되고 피지에서 실행 가능한 반자동 파이프라인을 활용하여 세포 염색에서 분석에 이르기까지 포괄적인 가이드를 제공합니다. 또한 데이터 관리를 간소화하기 위해 사용자 친화적인 Python 스크립트를 제공하며, Google Colab 노트북에서 공개적으로 액세스할 수 있습니다. 당사의 접근 방식은 다양한 상황에서 다양한 핵 조직 패턴을 가진 단백질에 대해 매우 유익한 면역형광 분석을 수행하는 데 효능이 있음을 입증했습니다.
Introduction
진핵생물 게놈(eukaryotic genome)의 조직은 후성유전학적 변형(epigenetic modification)1의 여러 층에 의해 지배되며, 핵체 또는 응축물(vaultates)2이라고 불리는 특수한 구획 내에서 발생할 수 있는 여러 핵 기능을 조정한다. 이러한 구조 내에서 전사 시작3, RNA 처리 4,5,6, DNA 복구 7,8, 리보솜 생물 발생 9,10,11 및 헤테로크로마틴 조절12,13과 같은 과정이 발생합니다. 핵체의 조절은 위상 분리 원칙14,15에 따라 세포 요구 사항을 수용하기 위해 공간적 차원과 시간적 차원 모두에 걸쳐 조정됩니다. 결과적으로, 이러한 물체는 기능적 구성 요소가 조립되고 분해되는 일시적인 공장으로 기능하여 크기와 공간 분포의 변화를 겪습니다. 따라서 현미경을 통해 핵 단백질의 특성을 이해하면 핵 단백질의 물체 형성 경향과 다양한 세포 조건에서의 공간 배열을 포함하여 핵 단백질의 기능적 역할에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 형광 현미경 검사는 핵 단백질을 연구하는 데 널리 사용되는 방법으로, 형광 항체를 통해 검출하거나 형광 단백질 리포터16,17로 표적을 직접 표현할 수 있습니다.
이러한 맥락에서, 핵체는 밝은 초점(bright foci) 또는 푼크타(puncta)로 나타나며, 현저한 구형도(sphericity)를 가지므로 주변 환경과 쉽게 구별할 수 있다(16,18). STORM 및 PALM과 같은 초고해상도 기술은 향상된 해상도(최대 10nm)19를 제공하여 특정 응축수(20)의 구조 및 구성을 보다 정확하게 특성화할 수 있습니다. 그러나 장비 비용과 데이터 분석에 필요한 전문 기술로 인해 접근성이 제한됩니다. 따라서 컨포칼 현미경은 해상도와 더 넓은 사용 사이의 유리한 균형으로 인해 여전히 인기가 있습니다. 이러한 인기는 초점을 벗어난 빛의 본질적인 제거에 의해 촉진되며, 이는 정확한 세분화를 위한 광범위한 후처리 절차의 필요성, 연구 기관에서의 광범위한 가용성, 효과적인 획득 시간 및 일반적으로 효율적인 샘플 준비에 대한 요구 사항을 줄입니다. 그러나 다양한 세포 조건에서 면역형광 분석을 사용하여 단백질 분포, 조립 또는 확산을 정확하게 측정하는 것은 기존의 많은 방법에는 다양한 분포 패턴을 가진 단백질에 적합한 파라미터를 선택하는 방법에 대한 지침이 부족하기 때문에 문제가 발생합니다21. 또한 데이터 분석 경험이 제한된 사용자에게는 대량의 데이터를 처리하는 것이 어려울 수 있으며, 결과의 생물학적 중요성을 손상시킬 수 있습니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 면역형광 준비 및 데이터 분석을 위한 상세한 단계별 프로토콜을 도입하여 다양한 조직 패턴으로 단백질 염색을 정량화하는 편향되지 않은 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다(그림 1). 이 반자동 파이프라인은 계산 및 이미징 분석에 대한 전문 지식이 제한된 사용자를 위해 설계되었습니다. 두 가지 확립된 피지 플러그인인 FindFoci22 및 3D suite23의 기능을 결합합니다. FindFoci의 정확한 초점 식별 기능을 3D 제품군이 제공하는 3D 공간의 물체 식별 및 세분화 기능과 통합함으로써 우리의 접근 방식은 각 획득 필드에 대해 채널당 두 개의 CSV 파일을 생성합니다. 이 파일에는 세포당 초점의 수, 핵 중심에서 초점까지의 거리, 미만성 단백질 염색을 위해 도입한 비균질성 계수(IC)와 같은 다양한 유형의 신호 분포에 적합한 메트릭을 쉽게 계산할 수 있는 보완 정보가 포함되어 있습니다. 또한 데이터 처리 기술이 제한된 사용자에게 데이터 외삽이 시간이 많이 걸릴 수 있음을 알고 있습니다. 이 프로세스를 간소화하기 위해 각 실험에 대해 수집된 모든 측정값을 단일 파일로 자동으로 컴파일하는 Python 스크립트를 제공합니다. 사용자는 프로그래밍 언어 소프트웨어를 설치할 필요 없이 이 스크립트를 실행할 수 있습니다. 브라우저에서 직접 Python 스크립트를 작성할 수 있는 클라우드 기반 플랫폼인 Google Colab에서 실행 코드를 제공합니다. 이를 통해 우리의 방법은 직관적이고 즉시 사용할 수 있도록 쉽게 액세스할 수 있습니다.
우리는 두 가지 핵 단백질, 즉 BRD4(Bromodomain-possession protein 4) 및 SUZ12(Suppressor of zeste-12)의 신호 분포 변화를 분석하고 정량화하는 데 있어 프로토콜의 효과를 입증합니다. BRD4는 중합효소 II 의존성 전사 개시24,25와 관련된 응축물을 형성하는 것으로 알려진 매개체 복합체 내에서 잘 문서화된 코액티베이터 단백질입니다. SUZ12는 H3K27me3 히스톤 변형26,27의 침착을 조절하는 Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2)의 단백질 구성 요소입니다. 이들 단백질은 두 가지 별개의 세포 유형 내에서 서로 다른 패턴을 보인다: 갓 분리된 인간 CD4+ naive T 세포는 정지 상태이며 느린 전사 활성 속도를 보이며, 체외 분화된 TH1 CD4+ 세포는 전문화되고 증식하는 effector cell로서 증가된 transcription28을 보인다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 인간 T 림프구에서 핵 단백질에 대한 면역형광 실험을 수행하는 방법을 제시한다. 이 방법은 앞서 설명한 바와 같이 고정 및 투과화 단계에서의 사소한 수정을 통해 다양한 세포 유형에 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다(30,31).
당사의 이미징 워크플로우는 문헌에 요약된 확립된 기술, 특히 FindFoci 및 3D Suite<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
당사는 INGM 이미징 시설(특히 C. Cordiglieri 및 A. Fasciani)과 INGM FACS 선별 시설(특히 M.C Crosti)의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다(Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM), Milan, Italy). 우리는 M. Giannaccari의 기술 정보 지원에 감사드립니다. 이 작업은 F.M. Ricerca Finalizzata(보조금 번호 GR-2018-12365280), Fondazione AIRC(보조금 번호 2022 27066), Fondazione Cariplo(보조금 번호 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica(FRRB CP2_12/2018,), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza(PNRR) (보조금 번호 G43C22002620007) 및 Progetti di Rilevante Interesse Nazionale(PRIN)(보조금 번호 2022PKF9S)에서 B. B.
Materials
| 1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
| 10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
| 20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
| 200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
| antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
| Dry ice | Step 1.3.1. | ||
| Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
| FIJI Version 2.14.0 | – | – | Protocol section 3 |
| Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
| Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
| human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
| Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | – | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
| Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
| Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
| poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Primary antibody – BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
| Primary antibody – SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
| Tweezers | – | – | Protocol section 1 |
References
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