خط أنابيب متعدد الاستخدامات لتحليل التغيرات الديناميكية في الأجسام النووية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا
Summary
تصف هذه الطريقة بروتوكول التألق المناعي وخط أنابيب القياس الكمي لتقييم توزيع البروتين مع أنماط تنظيم نووية متنوعة في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة ، بدءا من إعداد العينات والاستمرار في تنفيذ التحليل شبه الآلي في فيجي ، وينتهي بمعالجة البيانات بواسطة دفتر ملاحظات Google Colab.
Abstract
تحدث العمليات النووية المختلفة ، مثل التحكم في النسخ ، داخل هياكل منفصلة تعرف باسم البؤر التي يمكن تمييزها من خلال تقنية التألق المناعي. إن التحقيق في ديناميكيات هذه البؤر في ظل ظروف خلوية متنوعة عبر الفحص المجهري يعطي رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية التي تحكم الهوية الخلوية ووظائفها. ومع ذلك ، فإن إجراء فحوصات التألق المناعي عبر أنواع مختلفة من الخلايا وتقييم التغيرات في تجميع هذه البؤر ونشرها وتوزيعها يمثل العديد من التحديات. تشمل هذه التحديات تعقيدات في إعداد العينات ، وتحديد المعلمات لتحليل بيانات التصوير ، وإدارة أحجام البيانات الكبيرة. علاوة على ذلك ، غالبا ما يتم تصميم مهام سير عمل التصوير الحالية للمستخدمين الأكفاء ، مما يحد من إمكانية الوصول إلى جمهور أوسع.
في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول تألق مناعي محسن مصمم خصيصا للتحقيق في البروتينات النووية في أنواع مختلفة من الخلايا التائية الأولية البشرية التي يمكن تخصيصها لأي بروتين مهم ونوع الخلية. علاوة على ذلك ، نقدم طريقة لقياس تلطيخ البروتين بشكل غير متحيز ، سواء كانت تشكل بؤرا متميزة أو تظهر توزيعا نوويا منتشرا.
تقدم طريقتنا المقترحة دليلا شاملا ، من التلوين الخلوي إلى التحليل ، والاستفادة من خط أنابيب شبه آلي تم تطويره في Jython وقابل للتنفيذ في فيجي. علاوة على ذلك ، نقدم نصا برمجيا سهل الاستخدام من Python لتبسيط إدارة البيانات ، ويمكن الوصول إليه بشكل عام على دفتر ملاحظات Google Colab. وقد أثبت نهجنا فعاليته في إنتاج تحليلات عالية الإثراء للبروتينات ذات الأنماط المتنوعة للتنظيم النووي عبر سياقات مختلفة.
Introduction
يخضع تنظيم الجينوم حقيقي النواة لطبقات متعددة من التعديلات اللاجينية1 ، وتنسيق العديد من الوظائف النووية التي يمكن أن تحدث داخل مقصورات متخصصة تسمى الأجسام النووية أو المكثفات2. ضمن هذه الهياكل ، تتم عمليات مثل بدء النسخ3 ، ومعالجة الحمض النووي الريبي4،5،6 ، وإصلاح الحمض النووي7،8 ، والتكوين الحيوي للريبوسوم9،10،11 ، وتنظيم heterochromatin12،13. يتكيف تنظيم الأجسام النووية على كل من الأبعاد المكانية والزمانية لاستيعاب المتطلبات الخلوية ، مسترشدا بمبادئ فصل الطور14,15. وبالتالي ، تعمل هذه الهيئات كمصانع عابرة حيث تتجمع المكونات الوظيفية وتفكك ، وتخضع لتغييرات في الحجم والتوزيع المكاني. ومن ثم ، فإن فهم خصائص البروتينات النووية عن طريق الفحص المجهري ، بما في ذلك ميلها لتشكيل الأجسام وترتيبها المكاني في الظروف الخلوية المختلفة ، يوفر رؤى قيمة حول أدوارها الوظيفية. الفحص المجهري الفلوري هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع لدراسة البروتينات النووية ، مما يسمح باكتشافها من خلال الأجسام المضادة الفلورية أو التعبير المباشر عن الأهداف باستخدام مراسل بروتين الفلورسنت16,17.
في هذا السياق ، تظهر الأجسام النووية كبؤر ساطعة أو نقاط ، مع درجة ملحوظة من الكروية ، مما يسهل تمييزها عن البيئة المحيطة16,18. تتيح التقنيات فائقة الدقة مثل STORM و PALM ، من خلال توفير دقة محسنة (تصل إلى 10 نانومتر) 19 ، توصيفا أكثر دقة لهيكل وتكوين مكثفات محددة20. ومع ذلك ، فإن إمكانية الوصول إليها محدودة بسبب نفقات المعدات والمهارات المتخصصة اللازمة لتحليل البيانات. لذلك ، يظل الفحص المجهري متحد البؤر شائعا نظرا لتوازنه الإيجابي بين الدقة والاستخدام الأوسع. يتم تسهيل هذه الشعبية من خلال الإزالة المتأصلة للضوء خارج التركيز البؤري ، مما يقلل من الحاجة إلى إجراءات ما بعد المعالجة المكثفة للتجزئة الدقيقة ، وتوافره على نطاق واسع في معاهد البحوث ، ووقت اكتسابه الفعال ، وإعداد العينات الذي عادة ما يكون فعالا. ومع ذلك ، فإن القياس الدقيق لتوزيع البروتين أو تجميعه أو انتشاره باستخدام مقايسات التألق المناعي عبر الظروف الخلوية المتنوعة يشكل تحديات ، حيث تفتقر العديد من الطرق الحالية إلى إرشادات حول اختيار المعلمات المناسبة للبروتينات ذات أنماط التوزيع المختلفة21. علاوة على ذلك ، قد يكون التعامل مع حجم البيانات الكبير الناتج أمرا شاقا للمستخدمين ذوي الخبرة المحدودة في تحليل البيانات ، مما قد يضر بالأهمية البيولوجية للنتائج.
لمواجهة هذه التحديات ، نقدم بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لإعداد التألق المناعي وتحليل البيانات ، بهدف توفير طريقة غير متحيزة لقياس تلطيخ البروتين بأنماط تنظيمية مختلفة (الشكل 1). تم تصميم هذا المسار شبه الآلي للمستخدمين ذوي الخبرة المحدودة في التحليل الحسابي والتصويري. فهو يجمع بين وظائف اثنين من المكونات الإضافية فيجي المعمول بها: FindFoci22 و 3D جناح23. من خلال دمج قدرة تحديد البؤر الدقيقة ل FindFoci مع ميزات تحديد الكائنات والتجزئة في مساحة ثلاثية الأبعاد التي توفرها مجموعة 3D ، يقوم نهجنا بإنشاء ملفين CSV لكل قناة لكل مجال اكتساب. تحتوي هذه الملفات على معلومات تكميلية تسهل حساب المقاييس المناسبة لأنواع مختلفة من توزيع الإشارات ، مثل عدد البؤر لكل خلية ، ومسافة البؤر من المركز النووي ، ومعامل عدم التجانس (IC) ، الذي قدمناه لتلطيخ البروتين المنتشر. بالإضافة إلى ذلك ، نقر بأن استقراء البيانات يمكن أن يستغرق وقتا طويلا للمستخدمين ذوي المهارات المحدودة في معالجة البيانات. لتبسيط هذه العملية ، نقدم برنامج Python النصي الذي يجمع تلقائيا جميع القياسات التي تم جمعها في ملف واحد لكل تجربة. يمكن للمستخدمين تنفيذ هذا البرنامج النصي دون الحاجة إلى تثبيت أي برنامج لغة برمجة. نحن نقدم رمزا قابلا للتنفيذ على Google Colab ، وهو نظام أساسي قائم على السحابة يسمح بكتابة نصوص Python مباشرة في المتصفح. هذا يضمن أن طريقتنا بديهية ويمكن الوصول إليها بسهولة للاستخدام الفوري.
لقد أثبتنا فعالية بروتوكولنا في تحليل وقياس التغيرات في توزيع الإشارات لبروتينين نوويين: البروتين 4 المحتوي على البرومودومين (BRD4) ومثبط zeste-12 (SUZ12). BRD4 هو بروتين منشط موثق جيدا داخل مجمع الوسيط المعروف بتكوين المكثفات المرتبطة ببدء النسخ المعتمد على البلمرةII 24,25. SUZ12 هو مكون بروتيني في مجمع Polycomb القمعي 2 (PRC2) المسؤول عن تنظيم ترسب تعديل هيستون H3K27me326,27. تظهر هذه البروتينات أنماطا مختلفة داخل نوعين متميزين من الخلايا: الخلايا التائية البشرية الساذجة CD4 + المعزولة حديثا ، والتي تكون هادئة وتظهر معدلات بطيئة من نشاط النسخ ، وخلايا TH1 CD4 + المتمايزة في المختبر ، وهي خلايا مستجيبة متخصصة ومتكاثرة تظهر زيادة النسخ28.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لإجراء تجارب التألق المناعي على البروتينات النووية في الخلايا الليمفاوية التائية البشرية. توفر هذه الطريقة مرونة للاستخدام مع أنواع الخلايا المختلفة من خلال تعديلات طفيفة في خطوات التثبيت والنفاذية ، كما هو موضح سابقا30,31.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بالمساعدة العلمية والتقنية التي قدمها مرفق التصوير INGM ، ولا سيما C. Cordiglieri و A. Fasciani ، ومرفق الفرز INGM FACS على وجه الخصوص M.C Crosti (المعهد الوطني للجينات Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM) ، ميلانو ، إيطاليا). نعرب عن تقديرنا للسيد جياناكاري لدعمه المعلوماتي التقني. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية: مؤسسة كاريبلو (باندو جيوفاني ، منحة رقم 2018-0321) ومؤسسة AIRC (منحة رقم MFAG 29165) إلى F.M. Ricerca Finalizzata ، (منحة رقم GR-2018-12365280) ، مؤسسة AIRC (منحة رقم 2022 27066) ، مؤسسة كاريبلو (منحة رقم 2019-3416) ، مؤسسة إقليمية للبحوث الحيوية (FRRB CP2_12/2018) ،) البيانو الوطني للريبريزا و Resilienza (منحة رقم G43C22002620007) و Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (منحة رقم 2022PKF9S) إلى B. B.
Materials
| 1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
| 10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
| 20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
| 200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
| antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
| Dry ice | Step 1.3.1. | ||
| Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
| FIJI Version 2.14.0 | – | – | Protocol section 3 |
| Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
| Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
| human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
| Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | – | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
| Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
| Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
| poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Primary antibody – BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
| Primary antibody – SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
| Tweezers | – | – | Protocol section 1 |
References
- Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
- Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
- Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225.e24 (2021).
- Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
- Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
- Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646 (2011).
- Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379 (2019).
- Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562 (2019).
- Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
- Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
- Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
- Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
- Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
- Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
- Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Scalisi, S., Ahmad, A., D’Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).
- Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958 (2018).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
- Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082 (2021).
- Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
- Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
- Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
- Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).
.