Deze methode beschrijft een immunofluorescentieprotocol en kwantificeringspijplijn voor het evalueren van eiwitdistributie met gevarieerde nucleaire organisatiepatronen in menselijke T-lymfocyten. Dit protocol biedt stapsgewijze begeleiding, beginnend bij de monstervoorbereiding en doorlopend door de uitvoering van semi-geautomatiseerde analyse in Fiji, eindigend met gegevensverwerking door een Google Colab-notebook.
Verschillende nucleaire processen, zoals transcriptionele controle, vinden plaats binnen discrete structuren die bekend staan als foci en die waarneembaar zijn door de immunofluorescentietechniek. Het onderzoeken van de dynamiek van deze foci onder verschillende cellulaire omstandigheden via microscopie levert waardevolle inzichten op in de moleculaire mechanismen die de cellulaire identiteit en functies bepalen. Het uitvoeren van immunofluorescentietests in verschillende celtypen en het beoordelen van veranderingen in de assemblage, diffusie en distributie van deze foci brengt echter tal van uitdagingen met zich mee. Deze uitdagingen omvatten de complexiteit van de monstervoorbereiding, de bepaling van parameters voor het analyseren van beeldvormingsgegevens en het beheer van aanzienlijke gegevensvolumes. Bovendien zijn bestaande beeldvormingsworkflows vaak op maat gemaakt voor bekwame gebruikers, waardoor de toegankelijkheid voor een breder publiek wordt beperkt.
In deze studie introduceren we een geoptimaliseerd immunofluorescentieprotocol dat op maat is gemaakt voor het onderzoeken van nucleaire eiwitten in verschillende menselijke primaire T-celtypen en dat kan worden aangepast voor elk interessant eiwit en celtype. Verder presenteren we een methode voor het onbevooroordeeld kwantificeren van eiwitkleuring, of ze nu afzonderlijke brandpunten vormen of een diffuse nucleaire verdeling vertonen.
Onze voorgestelde methode biedt een uitgebreide gids, van cellulaire kleuring tot analyse, waarbij gebruik wordt gemaakt van een semi-geautomatiseerde pijplijn die is ontwikkeld in Jython en uitvoerbaar is in Fiji. Bovendien bieden we een gebruiksvriendelijk Python-script om het gegevensbeheer te stroomlijnen, openbaar toegankelijk op een Google Colab-notebook. Onze aanpak heeft doeltreffendheid aangetoond bij het leveren van zeer informatieve immunofluorescentieanalyses voor eiwitten met diverse patronen van nucleaire organisatie in verschillende contexten.
De organisatie van het eukaryote genoom wordt beheerst door meerdere lagen van epigenetische modificaties1, die verschillende nucleaire functies coördineren die kunnen voorkomen in gespecialiseerde compartimenten die nucleaire lichamen of condensaten worden genoemd2. Binnen deze structuren vinden processen plaats zoals transcriptie-initiatie3, RNA-verwerking 4,5,6, DNA-reparatie 7,8, ribosoombiogenese 9,10,11 en heterochromatineregulatie12,13. De regulatie van nucleaire lichamen past zich aan zowel ruimtelijke als temporele dimensies aan om aan de cellulaire vereisten te voldoen, geleid door principes van fasescheiding14,15. Bijgevolg functioneren deze lichamen als voorbijgaande fabrieken waar functionele componenten worden geassembleerd en gedemonteerd, waarbij veranderingen in grootte en ruimtelijke verdeling worden ondergaan. Daarom biedt het begrijpen van de kenmerken van nucleaire eiwitten door microscopie, inclusief hun neiging om lichamen te vormen en hun ruimtelijke rangschikking in verschillende cellulaire omstandigheden, waardevolle inzichten in hun functionele rollen. Fluorescentiemicroscopie is een veelgebruikte methode voor het bestuderen van nucleaire eiwitten, waardoor ze kunnen worden gedetecteerd door middel van fluorescerende antilichamen of door doelen direct tot expressie te brengen met een fluorescerende eiwitreporter16,17.
In deze context verschijnen nucleaire lichamen als heldere brandpunten of puncta, met een opmerkelijke mate van bolvormigheid, waardoor ze gemakkelijk te onderscheiden zijn van de omgeving16,18. Technieken met superresolutie, zoals STORM en PALM, zorgen voor een verbeterde resolutie (tot 10 nm)19 en maken een nauwkeurigere karakterisering van de structuur en samenstelling van specifieke condensaten mogelijk20. Hun toegankelijkheid wordt echter beperkt door de kosten van apparatuur en de gespecialiseerde vaardigheden die nodig zijn voor data-analyse. Daarom blijft confocale microscopie populair vanwege de gunstige balans tussen resolutie en breder gebruik. Een dergelijke populariteit wordt mogelijk gemaakt door de inherente verwijdering van onscherp licht, waardoor er minder uitgebreide nabewerkingsprocedures nodig zijn voor nauwkeurige segmentatie, de wijdverbreide beschikbaarheid in onderzoeksinstituten, de effectieve acquisitietijd en de monstervoorbereiding die doorgaans efficiënt is. Het nauwkeurig meten van eiwitdistributie, -assemblage of -diffusie met behulp van immunofluorescentietests in diverse cellulaire omstandigheden brengt echter uitdagingen met zich mee, aangezien veel bestaande methoden geen richtlijnen bieden voor het selecteren van geschikte parameters voor eiwitten met verschillende distributiepatronen21. Bovendien kan het verwerken van het resulterende grote gegevensvolume ontmoedigend zijn voor gebruikers met beperkte ervaring in gegevensanalyse, waardoor de biologische betekenis van de resultaten mogelijk in gevaar komt.
Om deze uitdagingen aan te pakken, introduceren we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor immunofluorescentievoorbereiding en data-analyse, met als doel een onbevooroordeelde methode te bieden voor het kwantificeren van eiwitkleuring met verschillende organisatiepatronen (Figuur 1). Deze semi-geautomatiseerde pijplijn is ontworpen voor gebruikers met beperkte expertise op het gebied van computationele en beeldvormingsanalyse. Het combineert de functionaliteiten van twee gevestigde Fiji-plug-ins: FindFoci22 en 3D suite23. Door de nauwkeurige foci-identificatiemogelijkheid van FindFoci te integreren met de objectidentificatie- en segmentatiefuncties in de 3D-ruimte die worden aangeboden door 3D suite, genereert onze aanpak twee CSV-bestanden per kanaal voor elk acquisitiegebied. Deze bestanden bevatten aanvullende informatie die de berekening vergemakkelijkt van metrieken die geschikt zijn voor verschillende soorten signaaldistributie, zoals het aantal foci per cel, de afstand van foci tot het nucleaire zwaartepunt en de inhomogeniteitscoëfficiënt (IC), die we hebben geïntroduceerd voor diffuse eiwitkleuring. Bovendien erkennen we dat gegevensextrapolatie tijdrovend kan zijn voor gebruikers met beperkte vaardigheden op het gebied van gegevensverwerking. Om dit proces te stroomlijnen, bieden we een Python-script dat alle verzamelde metingen automatisch samenvoegt tot één bestand voor elk experiment. Gebruikers kunnen dit script uitvoeren zonder dat ze programmeertaalsoftware hoeven te installeren. We bieden een uitvoerbare code op Google Colab, een cloudgebaseerd platform waarmee Python-scripts rechtstreeks in de browser kunnen worden geschreven. Dit zorgt ervoor dat onze methode intuïtief en gemakkelijk toegankelijk is voor direct gebruik.
We demonstreren de effectiviteit van ons protocol bij het analyseren en kwantificeren van veranderingen in de signaalverdeling van twee nucleaire eiwitten: Bromodomein-bevattend eiwit 4 (BRD4) en Suppressor van zeste-12 (SUZ12). BRD4 is een goed gedocumenteerd coactivatoreiwit binnen het Mediator-complex waarvan bekend is dat het condensaten vormt die geassocieerd zijn met polymerase II-afhankelijke transcriptionele initiatie24,25. SUZ12 is een eiwitcomponent van het Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) dat verantwoordelijk is voor het reguleren van de afzetting van H3K27me3 histonmodificatie26,27. Deze eiwitten vertonen verschillende patronen binnen twee verschillende celtypen: vers geïsoleerde menselijke CD4+-naïeve T-cellen, die in rust zijn en trage transcriptionele activiteit vertonen, en in vitro gedifferentieerde TH1 CD4+-cellen, die gespecialiseerde, prolifererende effectorcellen zijn die een verhoogde transcriptie vertonen28.
In deze studie presenteren we een methode voor het uitvoeren van immunofluorescentie-experimenten op nucleaire eiwitten in menselijke T-lymfocyten. Deze methode biedt flexibiliteit voor gebruik met verschillende celtypen door kleine aanpassingen in fixatie- en permeabilisatiestappen, zoals eerder beschreven 30,31.
Onze beeldvormingsworkflow bouwt voort op gevestigde technieken die in de literatuur worden beschreven, met name FindFoci e…
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn erkentelijk voor de wetenschappelijke en technische bijstand van de INGM Imaging Facility, in het bijzonder C. Cordiglieri en A. Fasciani, en de INGM FACS-sorteerfaciliteit in het bijzonder M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM), Milaan, Italië). We danken M. Giannaccari voor zijn technische informatica-ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de volgende subsidies: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, subsidie nr 2018-0321) en Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) aan F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,) Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) en Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) to B. B.
1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
Dry ice | Step 1.3.1. | ||
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
FIJI Version 2.14.0 | – | – | Protocol section 3 |
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | – | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
Primary antibody – BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
Primary antibody – SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
Tweezers | – | – | Protocol section 1 |
.