צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים
Summary
שיטה זו מתארת פרוטוקול אימונופלואורסנציה וצינור כימות להערכת התפלגות חלבונים עם דפוסי ארגון גרעיני מגוונים בלימפוציטים מסוג T אנושיים. פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב, החל מהכנת הדגימה והמשך בביצוע ניתוח חצי אוטומטי בפיג’י, וכלה בטיפול בנתונים על ידי מחברת Google Colab.
Abstract
תהליכים גרעיניים שונים, כגון בקרת שעתוק, מתרחשים בתוך מבנים בדידים המכונים מוקדים הניתנים להבחנה באמצעות טכניקת האימונופלואורסנציה. חקירת הדינמיקה של מוקדים אלה בתנאים תאיים מגוונים באמצעות מיקרוסקופיה מניבה תובנות חשובות על המנגנונים המולקולריים השולטים בזהות התאית ובתפקודיה. עם זאת, ביצוע בדיקות אימונופלואורסנציה על פני סוגי תאים שונים והערכת שינויים בהרכבה, דיפוזיה והפצה של מוקדים אלה מציבים אתגרים רבים. אתגרים אלה כוללים מורכבויות בהכנת הדגימות, קביעת פרמטרים לניתוח נתוני הדמיה וניהול נפחי נתונים משמעותיים. יתר על כן, תהליכי עבודה קיימים של הדמיה מותאמים לעתים קרובות למשתמשים מיומנים, ובכך מגבילים את הנגישות לקהל רחב יותר.
במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסנציה אופטימלי המותאם לחקר חלבונים גרעיניים בסוגים שונים של תאי T ראשוניים אנושיים שניתן להתאים אישית לכל חלבון מעניין וסוג תא. יתר על כן, אנו מציגים שיטה לכימות בלתי משוחד של צביעת חלבונים, בין אם הם יוצרים מוקדים נפרדים או מציגים פיזור גרעיני מפוזר.
השיטה המוצעת שלנו מציעה מדריך מקיף, החל מצביעה סלולרית ועד ניתוח, תוך מינוף צינור חצי אוטומטי שפותח ב- Jython וניתן להפעלה בפיג’י. יתר על כן, אנו מספקים סקריפט Python ידידותי למשתמש כדי לייעל את ניהול הנתונים, נגיש לציבור במחשב נייד של Google Colab. הגישה שלנו הוכיחה יעילות בהפקת ניתוחים אימונופלואורסצנטיים אינפורמטיביים ביותר עבור חלבונים עם דפוסים מגוונים של ארגון גרעיני בהקשרים שונים.
Introduction
ארגון הגנום האיקריוטי נשלט על ידי שכבות מרובות של שינויים אפיגנטיים1, המתאמים מספר פונקציות גרעיניות שיכולות להתרחש בתוך תאים מיוחדים הנקראים גופים גרעיניים או מעובים2. בתוך מבנים אלה מתרחשים תהליכים כגון התחלת שעתוק3, עיבוד RNA 4,5,6, תיקון DNA 7,8, ביוגנזה של ריבוזום 9,10,11 וויסות הטרוכרומטין12,13. ויסות הגופים הגרעיניים מתאים את עצמו הן לממד המרחבי והן לממד הזמני כדי להתאים לדרישות התא, מונחה על ידי עקרונות הפרדת פאזה14,15. כתוצאה מכך, גופים אלה מתפקדים כמפעלים ארעיים שבהם מרכיבים פונקציונליים מתכנסים ומתפרקים, ועוברים שינויים בגודל ובפיזור המרחבי. לפיכך, הבנת המאפיינים של חלבונים גרעיניים באמצעות מיקרוסקופיה, כולל נטייתם ליצור גופים וסידורם המרחבי בתנאים תאיים שונים, מציעה תובנות חשובות לגבי תפקידיהם הפונקציונליים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא שיטה נפוצה לחקר חלבונים גרעיניים, המאפשרת את זיהויים באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים או ביטוי ישיר של מטרות עם כתב חלבון פלואורסצנטי16,17.
בהקשר זה, גופים גרעיניים מופיעים כמוקדים בהירים או פונקטה, עם מידה ניכרת של ספיריות, מה שהופך אותם בקלות להבדיל מן הסביבה16,18. טכניקות סופר-רזולוציה כמו STORM ו-PALM, על ידי מתן רזולוציה משופרת (עד 10 ננומטר)19, מאפשרות אפיון מדויק יותר של המבנה וההרכב של מעבים ספציפיים20. עם זאת, הנגישות שלהם מוגבלת על ידי הוצאות ציוד ואת הכישורים המיוחדים הדרושים לניתוח נתונים. לכן, מיקרוסקופ קונפוקלי נשאר פופולרי בשל האיזון החיובי שלה בין רזולוציה לשימוש רחב יותר. פופולריות זו מתאפשרת על ידי הסרה מובנית של אור מחוץ לפוקוס, אשר מפחית את הדרישה להליכי עיבוד נרחבים לאחר עיבוד עבור פילוח מדויק, זמינותו הנרחבת במכוני מחקר, זמן הרכישה האפקטיבי שלו, והכנת דגימות שהיא בדרך כלל יעילה. עם זאת, מדידה מדויקת של פיזור, הרכבה או דיפוזיה של חלבונים באמצעות מבחני אימונופלואורסצנטיות על פני תנאים תאיים מגוונים מציבה אתגרים, שכן שיטות קיימות רבות חסרות הדרכה לבחירת פרמטרים מתאימים לחלבונים בעלי דפוסי התפלגות משתנים21. יתר על כן, טיפול בנפח הנתונים הגדול שנוצר יכול להיות מרתיע עבור משתמשים עם ניסיון מוגבל בניתוח נתונים, מה שעלול לסכן את המשמעות הביולוגית של התוצאות.
כדי להתמודד עם האתגרים האלה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב להכנת אימונופלואורסנציה וניתוח נתונים, במטרה לספק שיטה בלתי משוחדת לכימות צביעת חלבונים עם דפוסי ארגון שונים (איור 1). צינור חצי-אוטומטי זה מיועד למשתמשים בעלי מומחיות מוגבלת בניתוח חישובי והדמיה. הוא משלב את הפונקציות של שני תוספים פיג’י מבוססים: FindFoci22 ו 3D suite23. על ידי שילוב יכולת זיהוי המוקדים המדויקת של FindFoci עם תכונות זיהוי האובייקטים והפילוח במרחב התלת-ממדי המוצע על ידי חבילת 3D, הגישה שלנו מייצרת שני קבצי CSV לכל ערוץ עבור כל שדה רכישה. קבצים אלה מכילים מידע משלים המאפשר חישוב מדדים המתאימים לסוגים שונים של התפלגות אותות, כגון ספירת מוקדים לתא, מרחק המוקדים מהצנטרויד הגרעיני ומקדם אי-הומוגניות (IC), שהכנסנו לצביעת חלבונים מפוזרים. בנוסף, אנו מכירים בכך שאקסטרפולציה של נתונים עשויה לגזול זמן רב עבור משתמשים עם כישורי טיפול מוגבלים בנתונים. כדי לייעל תהליך זה, אנו מספקים סקריפט Python שאוסף באופן אוטומטי את כל המדידות שנאספו לקובץ אחד עבור כל ניסוי. משתמשים יכולים להפעיל סקריפט זה ללא צורך להתקין תוכנת שפת תכנות כלשהי. אנו מספקים קוד הפעלה ב- Google Colab, פלטפורמה מבוססת ענן המאפשרת כתיבת סקריפטים של Python ישירות בדפדפן. זה מבטיח שהשיטה שלנו אינטואיטיבית ונגישה לשימוש מיידי.
אנו מדגימים את יעילות הפרוטוקול שלנו בניתוח וכימות שינויים בהתפלגות אותות של שני חלבונים גרעיניים: חלבון המכיל ברומודומיין 4 (BRD4) ומדכא זסטה-12 (SUZ12). BRD4 הוא חלבון קו-אקטיבטור מתועד היטב בתוך קומפלקס Mediator הידוע כיוצר עיבויים הקשורים לחניכת שעתוק תלוית פולימראז II24,25. SUZ12 הוא רכיב חלבוני של Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) האחראי על ויסות התצהיר של שינוי היסטון H3K27me326,27. חלבונים אלה מציגים דפוסים שונים בתוך שני סוגי תאים נפרדים: תאי T נאיביים אנושיים CD4+ שבודדו זה עתה, שהם שקטים ומפגינים קצב איטי של פעילות שעתוק, ותאי TH1 CD4+ ממוינים במבחנה, שהם תאים משפיעים מתמחים ומתרבים המראים שעתוק מוגבר28.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה אנו מציגים שיטה לביצוע ניסויים אימונופלואורסנטיים על חלבונים גרעיניים בלימפוציטים אנושיים מסוג T. שיטה זו מציעה גמישות לשימוש עם סוגי תאים שונים באמצעות שינויים קלים בשלבי הקיבוע והחלחול, כפי שתואר קודם לכן30,31.
תהליך העבודה שלנו לה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בסיוע המדעי והטכני של מתקן ההדמיה של INGM, בפרט, C. Cordiglieri ו- A. Fasciani, ומתקן המיון של INGM FACS בפרט M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM), מילאנו, איטליה). אנו מודים ל- M. Giannaccari על תמיכתו הטכנית האינפורמטית. עבודה זו מומנה על ידי המענקים הבאים: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321) ו- Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) ל- F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,) Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) ו- Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) ל- B. B.
Materials
| 1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
| 10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
| 20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
| 200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
| antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
| Dry ice | Step 1.3.1. | ||
| Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
| FIJI Version 2.14.0 | – | – | Protocol section 3 |
| Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
| Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
| human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
| Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | – | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
| Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
| Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
| poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Primary antibody – BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
| Primary antibody – SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
| Tweezers | – | – | Protocol section 1 |
References
- Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
- Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
- Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225.e24 (2021).
- Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
- Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
- Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646 (2011).
- Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379 (2019).
- Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562 (2019).
- Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
- Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
- Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
- Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
- Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
- Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
- Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Scalisi, S., Ahmad, A., D’Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).
- Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958 (2018).
- Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
- Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
- Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
- Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082 (2021).
- Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
- Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
- Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
- Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).
.