Summary

Una pipeline versatile per l'analisi dei cambiamenti dinamici nei corpi nucleari in una varietà di tipi di cellule

Published: June 28, 2024
doi:

Summary

Questo metodo descrive un protocollo di immunofluorescenza e una pipeline di quantificazione per valutare la distribuzione proteica con vari modelli di organizzazione nucleare nei linfociti T umani. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo, a partire dalla preparazione del campione e proseguendo attraverso l’esecuzione di analisi semi-automatizzate nelle Fiji, concludendo con la gestione dei dati da parte di un taccuino Google Colab.

Abstract

Vari processi nucleari, come il controllo trascrizionale, si verificano all’interno di strutture discrete note come focolai che sono distinguibili attraverso la tecnica dell’immunofluorescenza. Lo studio della dinamica di questi focolai in diverse condizioni cellulari tramite microscopia fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l’identità e le funzioni cellulari. Tuttavia, l’esecuzione di saggi di immunofluorescenza su diversi tipi di cellule e la valutazione delle alterazioni nell’assemblaggio, nella diffusione e nella distribuzione di questi focolai presentano numerose sfide. Queste sfide comprendono complessità nella preparazione dei campioni, nella determinazione dei parametri per l’analisi dei dati di imaging e nella gestione di volumi di dati sostanziali. Inoltre, i flussi di lavoro di imaging esistenti sono spesso personalizzati per utenti esperti, limitando così l’accessibilità a un pubblico più ampio.

In questo studio, introduciamo un protocollo di immunofluorescenza ottimizzato su misura per lo studio delle proteine nucleari in diversi tipi di cellule T primarie umane che possono essere personalizzate per qualsiasi proteina di interesse e tipo di cellula. Inoltre, presentiamo un metodo per quantificare in modo imparziale la colorazione delle proteine, sia che formino focolai distinti sia che mostrino una distribuzione nucleare diffusa.

Il metodo proposto offre una guida completa, dalla colorazione cellulare all’analisi, sfruttando una pipeline semi-automatizzata sviluppata a Jython ed eseguibile nelle Fiji. Inoltre, forniamo uno script Python di facile utilizzo per semplificare la gestione dei dati, accessibile pubblicamente su un notebook Google Colab. Il nostro approccio ha dimostrato efficacia nel produrre analisi di immunofluorescenza altamente informative per proteine con diversi modelli di organizzazione nucleare in diversi contesti.

Introduction

L’organizzazione del genoma eucariotico è governata da più strati di modificazioni epigenetiche1, coordinando diverse funzioni nucleari che possono verificarsi all’interno di compartimenti specializzati chiamati corpi nucleari o condensati2. All’interno di queste strutture, avvengono processi come l’inizio della trascrizione3, l’elaborazione dell’RNA 4,5,6, la riparazione del DNA 7,8, la biogenesi dei ribosomi 9,10,11 e la regolazione dell’eterocromatina12,13. La regolazione dei corpi nucleari si adatta sia alle dimensioni spaziali che temporali per soddisfare le esigenze cellulari, guidata dai principi della separazione di fase14,15. Di conseguenza, questi corpi funzionano come fabbriche transitorie in cui i componenti funzionali si assemblano e si smontano, subendo cambiamenti nelle dimensioni e nella distribuzione spaziale. Pertanto, la comprensione delle caratteristiche delle proteine nucleari al microscopio, compresa la loro propensione a formare corpi e la loro disposizione spaziale in diverse condizioni cellulari, offre preziose informazioni sui loro ruoli funzionali. La microscopia a fluorescenza è un metodo ampiamente utilizzato per lo studio delle proteine nucleari, consentendo la loro rilevazione attraverso anticorpi fluorescenti o esprimendo direttamente bersagli con un reporter di proteine fluorescenti16,17.

In questo contesto, i corpi nucleari appaiono come focolai luminosi o punti, con un notevole grado di sfericità, che li rende facilmente distinguibili dall’ambiente circostante16,18. Tecniche di super-risoluzione come STORM e PALM, fornendo una risoluzione migliorata (fino a 10 nm)19, consentono una caratterizzazione più precisa della struttura e della composizione di specifici condensati20. Tuttavia, la loro accessibilità è limitata dalle spese per le attrezzature e dalle competenze specialistiche necessarie per l’analisi dei dati. Pertanto, la microscopia confocale rimane popolare grazie al suo favorevole equilibrio tra risoluzione e utilizzo più ampio. Tale popolarità è facilitata dalla rimozione intrinseca della luce sfocata, che riduce la necessità di ampie procedure di post-elaborazione per una segmentazione accurata, la sua ampia disponibilità negli istituti di ricerca, il suo tempo di acquisizione effettivo e la preparazione del campione che è tipicamente efficiente. Tuttavia, la misurazione accurata della distribuzione, dell’assemblaggio o della diffusione delle proteine utilizzando saggi di immunofluorescenza in diverse condizioni cellulari pone delle sfide, poiché molti metodi esistenti non forniscono indicazioni sulla selezione di parametri adeguati per proteine con modelli di distribuzione variabili21. Inoltre, la gestione del grande volume di dati risultante può essere scoraggiante per gli utenti con esperienza limitata nell’analisi dei dati, compromettendo potenzialmente il significato biologico dei risultati.

Per affrontare queste sfide, introduciamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per la preparazione dell’immunofluorescenza e l’analisi dei dati, con l’obiettivo di fornire un metodo imparziale per quantificare la colorazione delle proteine con vari modelli di organizzazione (Figura 1). Questa pipeline semi-automatizzata è progettata per utenti con competenze limitate nell’analisi computazionale e di imaging. Combina le funzionalità di due affermati plug-in delle Fiji: FindFoci22 e 3D suite23. Integrando la capacità di identificazione precisa dei punti focali di FindFoci con le funzionalità di identificazione e segmentazione degli oggetti nello spazio 3D offerte dalla suite 3D, il nostro approccio genera due file CSV per canale per ogni campo di acquisizione. Questi file contengono informazioni complementari che facilitano il calcolo di metriche adatte a vari tipi di distribuzione del segnale, come il conteggio dei focolai per cellula, la distanza dei focolai dal centroide nucleare e il coefficiente di disomogeneità (IC), che abbiamo introdotto per la colorazione diffusa delle proteine. Inoltre, riconosciamo che l’estrapolazione dei dati può richiedere molto tempo per gli utenti con limitate capacità di gestione dei dati. Per semplificare questo processo, forniamo uno script Python che compila automaticamente tutte le misurazioni raccolte in un unico file per ogni esperimento. Gli utenti possono eseguire questo script senza la necessità di installare alcun software di linguaggio di programmazione. Forniamo un codice eseguibile su Google Colab, una piattaforma basata su cloud che permette la scrittura di script Python direttamente nel browser. Ciò garantisce che il nostro metodo sia intuitivo e facilmente accessibile per un uso immediato.

Dimostriamo l’efficacia del nostro protocollo nell’analizzare e quantificare le alterazioni nella distribuzione del segnale di due proteine nucleari: la proteina 4 contenente il bromodominio (BRD4) e il soppressore di zeste-12 (SUZ12). BRD4 è una proteina coattivatrice ben documentata all’interno del complesso mediatore nota per formare condensati associati all’inizio trascrizionale dipendente dalla polimerasi II24,25. SUZ12 è un componente proteico del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsabile della regolazione della deposizione della modificazione istonica H3K27me326,27. Queste proteine mostrano modelli diversi all’interno di due tipi cellulari distinti: le cellule T umane CD4+ naive appena isolate, che sono quiescenti e mostrano bassi tassi di attività trascrizionale, e le cellule TH1 CD4+ differenziate in vitro, che sono cellule effettrici specializzate e proliferanti che mostrano un aumento della trascrizione28.

Protocol

L’utilizzo di campioni umani a fini di ricerca è stato approvato dai Comitati Etici della Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milano) ed è stato ottenuto il consenso informato di tutti i soggetti (numeri di autorizzazione: 708_2020). Il protocollo è organizzato in tre sezioni principali: esecuzione dell’immunofluorescenza, acquisizione delle immagini e analisi delle immagini. In media, richiede 4 giorni lavorativi per essere completato (<stro…

Representative Results

Il protocollo delineato in questo metodo facilita la visualizzazione e la quantificazione delle alterazioni nella colorazione delle proteine nucleari all’interno delle cellule T primarie umane e può essere personalizzato per diversi tipi di cellule e bersagli proteici. Come casi di studio, abbiamo condotto e analizzato la colorazione di BRD4 e SUZ12 in cellule CD4+ naive e TH1. BRD4 mostra un pattern di colorazione ben punteggiato sia nelle cellule CD4<s…

Discussion

In questo studio, presentiamo un metodo per eseguire esperimenti di immunofluorescenza su proteine nucleari nei linfociti T umani. Questo metodo offre flessibilità per l’uso con vari tipi di cellule attraverso piccole modifiche nelle fasi di fissazione e permeabilizzazione, come descritto in precedenza30,31.

Il nostro flusso di lavoro di imaging si basa su tecniche consolidate descritte in letteratura, in particolare FindFoci e 3D Sui…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Si ringrazia l’assistenza scientifica e tecnica dell’INGM Imaging Facility, in particolare di C. Cordiglieri e A. Fasciani, e dell’INGM FACS sorting facility in particolare M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM), Milano, Italia). Ringraziamo M. Giannaccari per il suo supporto tecnico informatico. Questo lavoro è stato finanziato dai seguenti grant: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321) e Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) a F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) e Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) a B. B.

Materials

1.5 mL Safe-Lock Tubes Eppendord #0030121503 Protocol section 1
10 mL Serological pipettes VWR #612-3700 Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip Thermo Scientific #2149P-HR Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon #352070 Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip Thermo Scientific #2069-HR Protocol section 1
antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia Invitrogen #P36984 Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma #A7030 Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec #130-096-533 Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen Cat#D1306 Step 1.3.10.
Dry ice Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead Life Technologies #1131D magnetic beads step 1.1.4.
EtOH Carlo Erba #4146320 Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP BD Bioscences Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies #10270106 Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS Euroclone GEH17144003F32 Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0 Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) Electron Microscopy Sciences #72298-13 Step 1.2.1.
Glycerol Sigma #G5516 Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody Invitrogen A11036 Step 1.3.8.
HCl Sigma #320331 Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4 Miltenyi Biotec Cat#130-095-753 Step 1.1.4.
human recombinant IL-12 Miltenyi Biotec Cat#130-096-704 Step 1.1.4.
human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec Cat#130-097-744 Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope Leica Microsystems Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies #11140035 Step 1.1.4.
Microscope Slides VWR #631-1552 Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) BD Bioscience #557871 Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) BD Bioscience #552888 Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) Miltenyi Biotec #130-113-546 Step 1.1.3.
Multiwell 24 well Falcon #353047 Protocol section 1
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000 Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS Life Technologies #14190094 Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution Life Technologies #15070063 Step 1.1.4.
PFA Sigma #P6148 Step 1.2.4.
poly-L-lysine Sigma #P8920 1.2.1.
Primary antibody – BRD4 Abcam #ab128874 Step 1.3.6.
Primary antibody – SUZ12 Cel Signalling mAb #3737 Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I Life Technologies #61870010 Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate Life Technologies #11360039 Step 1.1.4.
Triton X-100 Sigma #T8787 Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20 Sigma #P9416 Step 1.3.
Tweezers Protocol section 1

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Di Gioia, V., Zamporlini, J., Vadalà, R., Parmigiani, E., Bodega, B., Marasca, F. A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types. J. Vis. Exp. (208), e66874, doi:10.3791/66874 (2024).

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