Questo metodo descrive un protocollo di immunofluorescenza e una pipeline di quantificazione per valutare la distribuzione proteica con vari modelli di organizzazione nucleare nei linfociti T umani. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo, a partire dalla preparazione del campione e proseguendo attraverso l’esecuzione di analisi semi-automatizzate nelle Fiji, concludendo con la gestione dei dati da parte di un taccuino Google Colab.
Vari processi nucleari, come il controllo trascrizionale, si verificano all’interno di strutture discrete note come focolai che sono distinguibili attraverso la tecnica dell’immunofluorescenza. Lo studio della dinamica di questi focolai in diverse condizioni cellulari tramite microscopia fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l’identità e le funzioni cellulari. Tuttavia, l’esecuzione di saggi di immunofluorescenza su diversi tipi di cellule e la valutazione delle alterazioni nell’assemblaggio, nella diffusione e nella distribuzione di questi focolai presentano numerose sfide. Queste sfide comprendono complessità nella preparazione dei campioni, nella determinazione dei parametri per l’analisi dei dati di imaging e nella gestione di volumi di dati sostanziali. Inoltre, i flussi di lavoro di imaging esistenti sono spesso personalizzati per utenti esperti, limitando così l’accessibilità a un pubblico più ampio.
In questo studio, introduciamo un protocollo di immunofluorescenza ottimizzato su misura per lo studio delle proteine nucleari in diversi tipi di cellule T primarie umane che possono essere personalizzate per qualsiasi proteina di interesse e tipo di cellula. Inoltre, presentiamo un metodo per quantificare in modo imparziale la colorazione delle proteine, sia che formino focolai distinti sia che mostrino una distribuzione nucleare diffusa.
Il metodo proposto offre una guida completa, dalla colorazione cellulare all’analisi, sfruttando una pipeline semi-automatizzata sviluppata a Jython ed eseguibile nelle Fiji. Inoltre, forniamo uno script Python di facile utilizzo per semplificare la gestione dei dati, accessibile pubblicamente su un notebook Google Colab. Il nostro approccio ha dimostrato efficacia nel produrre analisi di immunofluorescenza altamente informative per proteine con diversi modelli di organizzazione nucleare in diversi contesti.
L’organizzazione del genoma eucariotico è governata da più strati di modificazioni epigenetiche1, coordinando diverse funzioni nucleari che possono verificarsi all’interno di compartimenti specializzati chiamati corpi nucleari o condensati2. All’interno di queste strutture, avvengono processi come l’inizio della trascrizione3, l’elaborazione dell’RNA 4,5,6, la riparazione del DNA 7,8, la biogenesi dei ribosomi 9,10,11 e la regolazione dell’eterocromatina12,13. La regolazione dei corpi nucleari si adatta sia alle dimensioni spaziali che temporali per soddisfare le esigenze cellulari, guidata dai principi della separazione di fase14,15. Di conseguenza, questi corpi funzionano come fabbriche transitorie in cui i componenti funzionali si assemblano e si smontano, subendo cambiamenti nelle dimensioni e nella distribuzione spaziale. Pertanto, la comprensione delle caratteristiche delle proteine nucleari al microscopio, compresa la loro propensione a formare corpi e la loro disposizione spaziale in diverse condizioni cellulari, offre preziose informazioni sui loro ruoli funzionali. La microscopia a fluorescenza è un metodo ampiamente utilizzato per lo studio delle proteine nucleari, consentendo la loro rilevazione attraverso anticorpi fluorescenti o esprimendo direttamente bersagli con un reporter di proteine fluorescenti16,17.
In questo contesto, i corpi nucleari appaiono come focolai luminosi o punti, con un notevole grado di sfericità, che li rende facilmente distinguibili dall’ambiente circostante16,18. Tecniche di super-risoluzione come STORM e PALM, fornendo una risoluzione migliorata (fino a 10 nm)19, consentono una caratterizzazione più precisa della struttura e della composizione di specifici condensati20. Tuttavia, la loro accessibilità è limitata dalle spese per le attrezzature e dalle competenze specialistiche necessarie per l’analisi dei dati. Pertanto, la microscopia confocale rimane popolare grazie al suo favorevole equilibrio tra risoluzione e utilizzo più ampio. Tale popolarità è facilitata dalla rimozione intrinseca della luce sfocata, che riduce la necessità di ampie procedure di post-elaborazione per una segmentazione accurata, la sua ampia disponibilità negli istituti di ricerca, il suo tempo di acquisizione effettivo e la preparazione del campione che è tipicamente efficiente. Tuttavia, la misurazione accurata della distribuzione, dell’assemblaggio o della diffusione delle proteine utilizzando saggi di immunofluorescenza in diverse condizioni cellulari pone delle sfide, poiché molti metodi esistenti non forniscono indicazioni sulla selezione di parametri adeguati per proteine con modelli di distribuzione variabili21. Inoltre, la gestione del grande volume di dati risultante può essere scoraggiante per gli utenti con esperienza limitata nell’analisi dei dati, compromettendo potenzialmente il significato biologico dei risultati.
Per affrontare queste sfide, introduciamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per la preparazione dell’immunofluorescenza e l’analisi dei dati, con l’obiettivo di fornire un metodo imparziale per quantificare la colorazione delle proteine con vari modelli di organizzazione (Figura 1). Questa pipeline semi-automatizzata è progettata per utenti con competenze limitate nell’analisi computazionale e di imaging. Combina le funzionalità di due affermati plug-in delle Fiji: FindFoci22 e 3D suite23. Integrando la capacità di identificazione precisa dei punti focali di FindFoci con le funzionalità di identificazione e segmentazione degli oggetti nello spazio 3D offerte dalla suite 3D, il nostro approccio genera due file CSV per canale per ogni campo di acquisizione. Questi file contengono informazioni complementari che facilitano il calcolo di metriche adatte a vari tipi di distribuzione del segnale, come il conteggio dei focolai per cellula, la distanza dei focolai dal centroide nucleare e il coefficiente di disomogeneità (IC), che abbiamo introdotto per la colorazione diffusa delle proteine. Inoltre, riconosciamo che l’estrapolazione dei dati può richiedere molto tempo per gli utenti con limitate capacità di gestione dei dati. Per semplificare questo processo, forniamo uno script Python che compila automaticamente tutte le misurazioni raccolte in un unico file per ogni esperimento. Gli utenti possono eseguire questo script senza la necessità di installare alcun software di linguaggio di programmazione. Forniamo un codice eseguibile su Google Colab, una piattaforma basata su cloud che permette la scrittura di script Python direttamente nel browser. Ciò garantisce che il nostro metodo sia intuitivo e facilmente accessibile per un uso immediato.
Dimostriamo l’efficacia del nostro protocollo nell’analizzare e quantificare le alterazioni nella distribuzione del segnale di due proteine nucleari: la proteina 4 contenente il bromodominio (BRD4) e il soppressore di zeste-12 (SUZ12). BRD4 è una proteina coattivatrice ben documentata all’interno del complesso mediatore nota per formare condensati associati all’inizio trascrizionale dipendente dalla polimerasi II24,25. SUZ12 è un componente proteico del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsabile della regolazione della deposizione della modificazione istonica H3K27me326,27. Queste proteine mostrano modelli diversi all’interno di due tipi cellulari distinti: le cellule T umane CD4+ naive appena isolate, che sono quiescenti e mostrano bassi tassi di attività trascrizionale, e le cellule TH1 CD4+ differenziate in vitro, che sono cellule effettrici specializzate e proliferanti che mostrano un aumento della trascrizione28.
In questo studio, presentiamo un metodo per eseguire esperimenti di immunofluorescenza su proteine nucleari nei linfociti T umani. Questo metodo offre flessibilità per l’uso con vari tipi di cellule attraverso piccole modifiche nelle fasi di fissazione e permeabilizzazione, come descritto in precedenza30,31.
Il nostro flusso di lavoro di imaging si basa su tecniche consolidate descritte in letteratura, in particolare FindFoci e 3D Sui…
The authors have nothing to disclose.
Si ringrazia l’assistenza scientifica e tecnica dell’INGM Imaging Facility, in particolare di C. Cordiglieri e A. Fasciani, e dell’INGM FACS sorting facility in particolare M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM), Milano, Italia). Ringraziamo M. Giannaccari per il suo supporto tecnico informatico. Questo lavoro è stato finanziato dai seguenti grant: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321) e Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) a F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) e Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) a B. B.
1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
Dry ice | Step 1.3.1. | ||
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
FIJI Version 2.14.0 | – | – | Protocol section 3 |
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | – | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
Primary antibody – BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
Primary antibody – SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
Tweezers | – | – | Protocol section 1 |
.