Summary

Una línea versátil para analizar los cambios dinámicos en los cuerpos nucleares en una variedad de tipos de células

Published: June 28, 2024
doi:

Summary

Este método describe un protocolo de inmunofluorescencia y un canal de cuantificación para evaluar la distribución de proteínas con patrones de organización nuclear variados en linfocitos T humanos. Este protocolo proporciona orientación paso a paso, comenzando con la preparación de la muestra y continuando con la ejecución de análisis semiautomatizados en Fiji, concluyendo con el manejo de datos por parte de un cuaderno de Google Colab.

Abstract

Varios procesos nucleares, como el control transcripcional, ocurren dentro de estructuras discretas conocidas como focos que se pueden discernir a través de la técnica de inmunofluorescencia. La investigación de la dinámica de estos focos en diversas condiciones celulares a través de la microscopía proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares que gobiernan la identidad y las funciones celulares. Sin embargo, la realización de ensayos de inmunofluorescencia en diferentes tipos de células y la evaluación de las alteraciones en el ensamblaje, la difusión y la distribución de estos focos presentan numerosos desafíos. Estos desafíos abarcan complejidades en la preparación de muestras, la determinación de parámetros para analizar datos de imágenes y la gestión de volúmenes de datos sustanciales. Además, los flujos de trabajo de imágenes existentes a menudo se adaptan a usuarios competentes, lo que limita la accesibilidad a un público más amplio.

En este estudio, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia optimizado diseñado para investigar proteínas nucleares en diferentes tipos de células T primarias humanas que se pueden personalizar para cualquier proteína de interés y tipo de célula. Además, presentamos un método para cuantificar de forma no sesgada la tinción de proteínas, ya sea que formen focos distintos o exhiban una distribución nuclear difusa.

Nuestro método propuesto ofrece una guía completa, desde la tinción celular hasta el análisis, aprovechando una tubería semiautomatizada desarrollada en Jython y ejecutable en Fiji. Además, proporcionamos un script de Python fácil de usar para agilizar la gestión de datos, de acceso público en un cuaderno de Google Colab. Nuestro enfoque ha demostrado eficacia en la producción de análisis de inmunofluorescencia altamente informativos para proteínas con diversos patrones de organización nuclear en diferentes contextos.

Introduction

La organización del genoma eucariota está gobernada por múltiples capas de modificaciones epigenéticas1, que coordinan varias funciones nucleares que pueden ocurrir dentro de compartimentos especializados llamados cuerpos nucleares o condensados2. Dentro de estas estructuras, tienen lugar procesos como la iniciación de la transcripción3, el procesamiento del ARN 4,5,6, la reparación del ADN 7,8, la biogénesis del ribosoma 9,10,11 y la regulación de la heterocromatina12,13. La regulación de los cuerpos nucleares se ajusta en las dimensiones espaciales y temporales para adaptarse a los requisitos celulares, guiada por los principios de separación de fases14,15. En consecuencia, estos cuerpos funcionan como fábricas transitorias donde los componentes funcionales se ensamblan y desensamblan, sufriendo cambios en el tamaño y la distribución espacial. Por lo tanto, la comprensión de las características de las proteínas nucleares mediante microscopía, incluida su propensión a formar cuerpos y su disposición espacial en diferentes condiciones celulares, ofrece información valiosa sobre sus roles funcionales. La microscopía de fluorescencia es un método ampliamente utilizado para el estudio de proteínas nucleares, permitiendo su detección a través de anticuerpos fluorescentes o expresando directamente dianas con un reportero de proteínas fluorescentes16,17.

En este contexto, los cuerpos nucleares aparecen como focos brillantes o puncta, con un notable grado de esfericidad, lo que los hace fácilmente distinguibles del ambiente circundante 16,18. Las técnicas de superresolución como STORM y PALM, al proporcionar una resolución mejorada (hasta 10 nm)19, permiten una caracterización más precisa de la estructura y composición de condensados específicos20. Sin embargo, su accesibilidad está limitada por los gastos de equipo y las habilidades especializadas necesarias para el análisis de datos. Por lo tanto, la microscopía confocal sigue siendo popular debido a su equilibrio favorable entre resolución y uso más amplio. Esta popularidad se ve facilitada por la eliminación inherente de la luz desenfocada, que disminuye la necesidad de extensos procedimientos de posprocesamiento para una segmentación precisa, su amplia disponibilidad en los institutos de investigación, su tiempo de adquisición efectivo y la preparación de muestras que suele ser eficiente. Sin embargo, la medición precisa de la distribución, el ensamblaje o la difusión de proteínas mediante ensayos de inmunofluorescencia en diversas condiciones celulares plantea desafíos, ya que muchos métodos existentes carecen de orientación sobre la selección de parámetros adecuados para proteínas con diferentes patrones de distribución21. Además, el manejo del gran volumen de datos resultante puede ser desalentador para los usuarios con experiencia limitada en el análisis de datos, lo que puede comprometer la importancia biológica de los resultados.

Para abordar estos desafíos, presentamos un protocolo detallado paso a paso para la preparación de inmunofluorescencia y el análisis de datos, con el objetivo de proporcionar un método imparcial para cuantificar la tinción de proteínas con varios patrones de organización (Figura 1). Esta tubería semiautomatizada está diseñada para usuarios con experiencia limitada en análisis computacional y de imágenes. Combina las funcionalidades de dos plugins establecidos de Fiji: FindFoci22 y 3D suite23. Al integrar la capacidad de identificación precisa de focos de FindFoci con las funciones de identificación y segmentación de objetos en el espacio 3D que ofrece 3D suite, nuestro enfoque genera dos archivos CSV por canal para cada campo de adquisición. Estos archivos contienen información complementaria que facilita el cálculo de métricas adecuadas para varios tipos de distribución de señales, como el recuento de focos por célula, la distancia de los focos al centroide nuclear y el coeficiente de inhomogeneidad (CI), que hemos introducido para la tinción difusa de proteínas. Además, reconocemos que la extrapolación de datos puede llevar mucho tiempo para los usuarios con habilidades limitadas de manejo de datos. Para agilizar este proceso, proporcionamos un script de Python que compila automáticamente todas las mediciones recopiladas en un solo archivo para cada experimento. Los usuarios pueden ejecutar este script sin necesidad de instalar ningún software de lenguaje de programación. Proporcionamos un código ejecutable en Google Colab, una plataforma basada en la nube que permite la escritura de scripts de Python directamente en el navegador. Esto garantiza que nuestro método sea intuitivo y fácilmente accesible para su uso inmediato.

Demostramos la efectividad de nuestro protocolo en el análisis y cuantificación de alteraciones en la distribución de señales de dos proteínas nucleares: la proteína 4 que contiene bromodominio (BRD4) y el supresor de zeste-12 (SUZ12). BRD4 es una proteína coactivadora bien documentada dentro del complejo mediador conocida por formar condensados asociados con la iniciación transcripcional dependiente de la polimerasa II24,25. SUZ12 es un componente proteico del Complejo Represivo Polycomb 2 (PRC2) responsable de regular la deposición de la modificación de histonas H3K27me326,27. Estas proteínas exhiben diferentes patrones dentro de dos tipos de células distintas: las células T humanas CD4+ naïve recién aisladas, que están inactivas y exhiben tasas lentas de actividad transcripcional, y las células TH1 CD4+ diferenciadas in vitro, que son células efectoras proliferantes especializadas que muestran una mayor transcripción28.

Protocol

El uso de muestras humanas con fines de investigación fue aprobado por los Comités de Ética de la Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milán), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos (número de autorización: 708_2020). El protocolo se organiza en tres secciones principales: ejecución de inmunofluorescencia, adquisición de imágenes y análisis de imágenes. En promedio, requiere 4 días hábiles para completarse (<str…

Representative Results

El protocolo descrito en este método facilita la visualización y cuantificación de las alteraciones en la tinción de proteínas nucleares dentro de las células T primarias humanas, y se puede personalizar para diversos tipos de células y objetivos proteicos. Como casos de estudio, realizamos y analizamos la tinción de BRD4 y SUZ12 en células naïve y TH1 CD4+ . BRD4 muestra un patrón de tinción bien punteado tanto en las células TH1 …

Discussion

En este estudio, presentamos un método para realizar experimentos de inmunofluorescencia sobre proteínas nucleares en linfocitos T humanos. Este método ofrece flexibilidad para su uso con varios tipos de células a través de modificaciones menores en los pasos de fijación y permeabilización, como se describió anteriormente30,31.

Nuestro flujo de trabajo de imágenes se basa en técnicas establecidas descritas en la literatura, e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos la asistencia científica y técnica del INGM Imaging Facility, en particular, C. Cordiglieri y A. Fasciani, y de la instalación de clasificación INGM FACS en particular M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi’ (INGM), Milán, Italia). Agradecemos al Sr. Giannaccari por su apoyo técnico informático. Este trabajo fue financiado por las siguientes subvenciones: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, subvención n.º 2018-0321) y Fondazione AIRC (subvención n.º MFAG 29165) a F.M. Ricerca Finalizzata, (subvención n.º GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (subvención n.º 2022 27066), Fondazione Cariplo (subvención n.º 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (subvención n.º G43C22002620007) y Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (subvención n.º 2022PKF9S) a B. B.

Materials

1.5 mL Safe-Lock Tubes Eppendord #0030121503 Protocol section 1
10 mL Serological pipettes VWR #612-3700 Protocol section 1
20 µL barrier pipette tip Thermo Scientific #2149P-HR Protocol section 1
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon #352070 Protocol section 1
200 µL barrier pipette tip Thermo Scientific #2069-HR Protocol section 1
antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia Invitrogen #P36984 Step 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma #A7030 Step 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec #130-096-533 Step 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen Cat#D1306 Step 1.3.10.
Dry ice Step 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead Life Technologies #1131D magnetic beads step 1.1.4.
EtOH Carlo Erba #4146320 Step 1.2.1.1.
FACSAria SORP BD Bioscences Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies #10270106 Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUS Euroclone GEH17144003F32 Step 1.1.1.
FIJI Version 2.14.0 Protocol section 3
Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) Electron Microscopy Sciences #72298-13 Step 1.2.1.
Glycerol Sigma #G5516 Step 1.2.7-1.3.1.
Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody Invitrogen A11036 Step 1.3.8.
HCl Sigma #320331 Step 1.3.4.
human neutralizing anti-IL-4 Miltenyi Biotec Cat#130-095-753 Step 1.1.4.
human recombinant IL-12 Miltenyi Biotec Cat#130-096-704 Step 1.1.4.
human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec Cat#130-097-744 Step 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscope Leica Microsystems Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life Technologies #11140035 Step 1.1.4.
Microscope Slides VWR #631-1552 Step 1.3.12.
Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) BD Bioscience #557871 Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) BD Bioscience #552888 Step 1.1.3.
Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) Miltenyi Biotec #130-113-546 Step 1.1.3.
Multiwell 24 well Falcon #353047 Protocol section 1
Normal Goat Serum Invitrogen PCN5000 Step 1.3.6., 1.3.8.
PBS Life Technologies #14190094 Protocol section 1
Penicillin/Streptomycin solution Life Technologies #15070063 Step 1.1.4.
PFA Sigma #P6148 Step 1.2.4.
poly-L-lysine Sigma #P8920 1.2.1.
Primary antibody – BRD4 Abcam #ab128874 Step 1.3.6.
Primary antibody – SUZ12 Cel Signalling mAb #3737 Step 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I Life Technologies #61870010 Step 1.1.4.
Sodium Pyruvate Life Technologies #11360039 Step 1.1.4.
Triton X-100 Sigma #T8787 Step 1.2., 1.3.
TWEEN 20 Sigma #P9416 Step 1.3.
Tweezers Protocol section 1

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Di Gioia, V., Zamporlini, J., Vadalà, R., Parmigiani, E., Bodega, B., Marasca, F. A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types. J. Vis. Exp. (208), e66874, doi:10.3791/66874 (2024).

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