Summary

Baker'da Mitokondriyal Dönüşüm

Published: June 07, 2024
doi:

Summary

Bu çalışma, maya mitokondrisinin biyolistik bir yöntem kullanılarak nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır. Ayrıca, transformantların nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genom içinde hedef pozisyonda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını da gösteriyoruz.

Abstract

Ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae , onlarca yıldır mitokondriyal biyolojiyi anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu model, ökaryotlar arasındaki temel, korunmuş mitokondriyal yollar ve mantarlar veya mayaya özgü yollar hakkında bilgi sağlamıştır. S. cerevisiae’nin birçok yeteneğinden biri, şimdiye kadar sadece S. cerevisiae ve tek hücreli algler Chlamydomonas reinhardtii’de mümkün olan mitokondriyal genomu manipüle etme kapasitesidir. Maya mitokondrisinin biyolistik dönüşümü, bölgeye yönelik mutasyonları tanıtmamıza, gen yeniden düzenlemeleri yapmamıza ve muhabirleri tanıtmamıza olanak tanır. Bu yaklaşımlar esas olarak mitokondrideki yüksek derecede koordineli iki sürecin mekanizmalarını anlamak için kullanılır: mitoribozomlar tarafından translasyon ve solunum komplekslerinin ve ATP sentazın montajı. Bununla birlikte, mitokondriyal dönüşüm potansiyel olarak diğer yolları incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmada, maya mitokondrisinin yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile nasıl dönüştürüleceğini, amaçlanan dönüştürücünün nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genomda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını gösteriyoruz.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae mayası, mitokondriyal biyogenezi incelemek için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir modeldir. Maya anaerobik, fakültatif bir organizma olduğundan, solunumu bozan mutasyonların ortaya çıkmasının nedenlerini ve sonuçlarını kapsamlı bir şekilde incelemek mümkündür. Ek olarak, bu organizma mitokondriyal yolları incelemek için dost genetik ve biyokimyasal araçlara sahiptir. Bununla birlikte, solunum kompleksi montajı ve mitokondriyal protein sentezi mekanizmalarını keşfetmek için en güçlü kaynaklardan biri, mitokondriyi dönüştürme ve organelin genomunu değiştirme yeteneğidir. Daha önce, mitokondriyal DNA (mtDNA) nokta mutasyonları veya küçük delesyonlar/eklemeler 1,2,3,4,5, genleri silmek 6,7, gen yeniden düzenlemeleri yapmak 7,8, mitokondriyal proteinlereepitoplar eklemek 9,10, genleri çekirdekten mitokondriyetaşımak 11,12 ve BarStar13, GFP14,15, lusiferaz16 ve en yaygın kullanılan ARG8m17,18 gibi muhabir genlerini tanıtın. Mitokondriyal genom modifikasyonları, aksi takdirde anlaşılması zor olan mekanizmaları incelememize ve tanımlamamıza izin verdi. Örneğin, mitokondriyal DNA’daki COX1 lokusuna yerleştirilen ARG8m raportör geni, Mss51’in Cox1 biyogenezinde ikili bir role sahip olduğunu anlamak için çok önemliydi. Birincisi, COX1 mRNA’nın translasyonel bir aktivatörüdür ve ikincisi, yeni yapılan Cox1 proteini 7,19 için bir montaj şaperonudur. Bu çalışma, S. cerevisiae mitokondrisini dönüştürmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır. Mitokondriyal dönüşüm protokolü daha önce yayınlanmış olsa da 16,20,21,22,23, yöntemin farklı aşamalarını ve ayrıntılarını tam olarak anlamak için bir video aracılığıyla görsel bir yaklaşım şarttır. Yöntem çeşitli adımlardan oluşur ve dört genel aşamaya ayrılır:

Figure 1
Şekil 1: Yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile mitokondriyal dönüşüm prosedürüne genel bakış: 1) Tungsten parçacıkları sterilize edilir ve DNA kaplamasından önce hazırlanır. 2) WP’lerin yüzeyinde iki farklı plazmit çökeltilir. Biri, mitokondriyal matrise yönlendirilecek yapıyı içeren bir bakteri plazmitidir. Diğeri, bir oksotrofi markörü taşıyan bir nükleer maya ekspresyon vektörüdür. 3) Mitokondriyal DNA’dan (rho0) yoksun bir reseptör maya suşu, mitokondriyal gen ekspresyonunun34,35 herhangi bir glikoz baskılamasını uygulamayan galaktoz veya rafinoz gibi fermentatif bir karbon kaynağı üzerinde büyütülür. Kültür, bombardıman ortamını içeren petri kaplarına yayılır. 4) Plazmitlerle kaplanmış WP’ler, yüksek hızlı mikromermi bombardımanı ile reseptör suşuna vurulur. 5) Mitokondriyal plazmid içeren pozitif sentetik rhokoloniler, bir test edici suşla eşleştirilerek seçilir. 6) Mitokondriyal yapı, sentetik rho-suşun (donör) alıcı suş ile sitodüksiyon olarak bilinen bir işlemle çiftleştirilmesiyle istenen lokusta mitokondriyal genoma entegre edilir. 7) Mitokondriyal yapıyı taşıyan pozitif reseptör, haploid suş seçilir ve farklı ortamlarda saflaştırılır. Kısaltmalar: WP’ler = tungsten parçacıkları; mtDNA = mitokondriyal DNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Mitokondriyal genoma entegre olması amaçlanan DNA yapısı ile hücrelerin dönüşümü (Şekil 1, adım 1-4)
Tam bir mitokondriyal genom (rho+) içeren bir mayayı doğrudan dönüştürmek mümkün olsa da, hücrelerde mitokondriyal DNA (rho0) yoksa dönüşüm 10-20 kat daha verimlidir.24. Tungsten parçacıkları (WP’ler), birlikte dönüştürülecek iki farklı plazmit ile kaplanır. Birincisi, LEU2 veya URA3 gibi bir oksotrofi belirteci taşıyan bir maya 2 μ ekspresyon vektörüdür (örneğin, sırasıyla YEp351 veya YEp352). DNA’nın maya hücrelerine biyolistik girişi başarılı olursa, dönüştürücüler oksotrofi ortamında (yani, lösin veya urasil içermeyen bir ortam) büyüyecektir. Bu plazmit, nükleer plazmidi edinen hücrelerin ilk seçiminin yapılmasında yardımcı olur; Aksi takdirde, ortaya çıkan kolonilerin sayısı plakayı doyurur. İkinci plazmit, mitokondriyal genoma entegre edilmesi amaçlanan mitokondriyal yapıyı içeren bir bakteri plazmitidir (pBluescript veya benzeri gibi). Yapı, ilgilenilen mitokondriyal bölge ile rekombinasyon için en az 100 nt 5′ ve 3′ yan mitokondriyal dizi içermelidir. Deneyimlerimize göre, daha büyük yan dizilerin mitokondriyal genomdaki hedef lokus ile başarılı bir şekilde yeniden birleşme olasılığı daha yüksektir.

Spesifik bir örnek Şekil 225’te gösterilmiştir. Bu örnekte amaç, karşılık gelen proteinin (Cox1ΔC15) son 15 amino asidini kodlayan mitokondriyal COX1 geninin bölgesini silmekti (Şekil 2A). COX1ΔC15 mutasyonunu taşıyan bakteri plazmidi, genin 5′ ve 3′ çevrilmemiş bölgelerinin sırasıyla 395 nt ve 990 nt’sini içeriyordu. Plazmit, pBluescript’ten (pXPM61) türetildi ve 2 μ plazmid YEp352 ile birlikte WP’lerin yüzeyinde birlikte çökeltildi (Şekil 2B). WP’ler daha sonra mikromermi bombardımanı ile seçilen alıcı suşuna sokuldu (Şekil 2C). NAB6926 olarak adlandırılan bu suş, kar1-1 ve ade2 alellerini taşıyan bir MATa, rho0 suşudur (bu özelliklerin önemi aşağıda tartışılmıştır). Hücreler, 2 μ plazmidi edinenleri seçmek için urasil içermeyen bombardıman ortamı üzerine kaplandı (Şekil 2C). Hücreler 30 ° C’de 5-7 gece büyütüldü.

Mitokondriyal yapıyı içeren bakteri plazmidini ve oksotrofi markörünü taşıyan nükleer 2 μ plazmiti edinen hücrelerin seçimi (Şekil 1, adım 5)
Pozitif koloniler, mitokondrilerinde bakteri plazmidinin birçok kopyasını tutacaktır22. Dönüştürülmüş hücreler orijinal olarak rho0 olduğundan, plazmidde bulunan mitokondriyal yapının translasyonunu destekleyen hiçbir mitokondriyal dizi; bu nedenle, dönüştürülmüş mitokondriyal gen ifade edilmeyecektir. Mitokondriyal plazmidi elde eden maya kolonilerini tespit etmek için transformatörleri bir test suşu ile eşleştirmek gerekir. Test edici suşun mitokondriyal genomu, ilgilenilen genin işlevsel olmayan mutasyona uğramış bir versiyonunu içerir. Çiftleşmeden sonra, mitokondri birleşecek ve dönüştürülmüş plazmide dahil edilen mitokondriyal dizi, test edici suştan mutasyona uğramış mitokondriyal gen ile yeniden birleşecektir; sonuç olarak, WT geninin geri kazanılması, işlevi yeniden oluşturacaktır. Ortaya çıkan diploid, saptanabilir bir pozitif fenotipe sahip olacaktır (genellikle solunum ortamında veya arginin içermeyen bir ortamda büyüme kapasitesi). Mitokondride bakteri plazmidini taşıyan pozitif hücrelere “sentetik rho hücreleri” adı verilir. Şekil 2D’nin spesifik örneğinde, COX1ΔC15 yapısını (XPM199 olarak adlandırılır) taşıyan sentetik rho hücreleri, urasil içermeyen bir ortam üzerinde replika kaplanmıştır (bu, pozitif kolonilerin saflaştırıldığı ana plakadır). Ayrıca, işlevsel olmayan mutasyon cox1D369N içeren bir test cihazı suşu L4527 çimi üzerinde replika kaplandılar. İki gece çiftleştikten sonra, L45 ve XPM199’un mitokondriyal genomu yeniden birleşti ve fonksiyonel bir COX1 geni ile sonuçlandı; Bu nedenle, diploidler solunum ortamında büyüme yeteneğini geri kazandı. Ana plakadan pozitif kolonileri seçtik. Urasil içermeyen plakalar üzerine çizildiler ve saf sentetik rho-hücreleri elde etmek için seçici testler tekrarlandılar (Şekil 2E). Test plakasının sadece sentetik rhokolonilerin tanımlanması için olduğunu ve mutantların bu plakalardan geri kazanılamayacağını belirtmek önemlidir.

Yapının, amaçlanan suşun mitokondriyal genomuna entegrasyonu
Bu adım, sitodüksiyon28,29 adı verilen bir işlemle gerçekleştirilir (Şekil 1, adım 6). Bu yaklaşımda, sentetik rho– suşu (donör suşu), zıt eşleşme tipinin amaçlanan alıcı suşu ile eşleştirilir. Temel bir gereklilik, iki çiftleşme suşundan en az birinin nükleer füzyonu30 engellemek için kar1-1 mutasyonunu taşımasıdır. Bu nedenle, iki hücrenin çiftleşmesi iki çekirdekli bir zigot üretir (Şekil 3). Ebeveyn hücrelerden (verici ve alıcı) gelen mitokondriyal ağ birleşir ve mitokondriyal DNA molekülleri yeniden birleşir. İki çekirdekli zigotlar, haploid hücreler üretecek olan tomurcuklanmaya izin vermek için inkübe edilir/geri kazanılır. Bu haploidler, ebeveyn hücrelerinden birinin nükleer arka planını taşır. Benzer şekilde, haploidler mitokondriyal DNA’yı ebeveyn hücresinden veya ilgilenilen rekombine mitokondriyal DNA’dan taşıyabilir. Bununla birlikte, kar1-1 mutasyonu% 100 etkili değildir ve çiftleşme sırasında bazı gerçek diploidler oluşacaktır28,29. Sentetik rho– suşu (donör, XPM199) örnekteki kar1-1 alelini taşıdı. Seçici bir belirteç olarak, ade2 aleline sahipti ve bu da onu adenin için bir oksotrof haline getirdi (Şekil 4). Alıcı suş, raportör ARG8m’nin mitokondriyal genom 7’deki COX1 kodonlarının yerini aldığı cox1Δ::ARG8m yapısını taşıyan bir rho+ suşu olanXPM10 idi. Her iki hücre kültürünün karışımı, çiftleşmeye izin vermek için bir damla olarak bir YPD plakasına eklendi. 3-5 saat sonra, hücreler, çiftleşme ile ilişkili bir hücre şekli olan shmoos oluşumunu tespit etmek için bir ışık mikroskobu altında gözlemlendi (Şekil 3B). Kuluçka / geri kazanım süresinden sonra, binükleer zigotlar, donör hücrelerin büyümesini önlemek için adenin içermeyen bir ortam üzerine kaplandı.

İlgilenilen mitokondriyal genomu taşıyan haploid suşun seçimi (Şekil 1, adım 7)
Sitodeksiyondan sonra donör, alıcı ve diploid hücrelerin bir karışımı mevcuttur. Bu nedenle, iki çekirdekli zigotların inkübasyonundan/geri kazanımından sonra, ilgilenilen haploidleri tanımlamak ve saflaştırmak için hücrelerin farklı seçici ortamlarda büyütülmesi gerekir. Seçici ortam, vericinin genotiplerine, alıcı suşlara ve amaçlanan mitokondriyal yapıya bağlıdır. Bununla birlikte, genel olarak, seçici ortamın seçilmesinin mantığı şudur: i) inkübasyon / geri kazanımdan sonra, sitüldüksiyon karışımı, donör ebeveyn suşunun büyüyemediği seçici ortamda büyütülür. Şekil 4A,B’deki spesifik örnekte, donör (sentetik rho-suş) fonksiyonel olmayan ade2 alelini taşır. Bu nedenle, sitodüksiyon karışımı, adenin içermeyen orta boy bir plaka üzerinde inkübe edilmelidir. Bu ana plakadır. ii) Koloniler büyüdükten sonra, ana plaka, adenin içermeyen bir ortamda (ilgilenilen pozitif kolonilerin saflaştırılacağı yeni bir ana plaka oluşturmak için) ve daha sonra sadece diploidlerin büyüyebileceği bir ortamda tekrar kopyalanır. Bu, diploid kolonilerin yanlışlıkla daha fazla saflaştırılmasını önlemek için gereklidir. Şekil 4C’deki örnekte olduğu gibi, lösin içermeyen ortamlarda sadece diploidler büyüyebilir. iii) Ana plaka, yalnızca ilgilenilen mitokondriyal DNA’yı içeren alıcı haploidlerin büyüyeceği ortamda da çoğaltılır. Şekil 4C örneğinde, Cox1ΔC15 proteini işlevsel olduğundan, haploidler karbon kaynağı olarak etanol/gliserol içeren solunum ortamlarında büyür. İlgilenilen mtDNA’yı taşıyan ortaya çıkan rho+ suşu XPM20925 olarak adlandırıldı. Şekil 2 ve Şekil 4’te kullanılan suşlar Tablo 1’de listelenmiştir.

Figure 2
Şekil 2: Mitokondriyal dönüşümün belirli bir örneğini ve pozitif rho hücrelerinin seçimini açıklayan diyagram. (A) Mitokondriyal genomun amaçlanan modifikasyonu, Cox1 alt biriminin (Cox1ΔC15) son 15 amino asidini kodlayan bölgenin silinmesiydi. (B) WP’ler, maya hücrelerini dönüştürmek için iki plazmit ile kaplandı. Biri, çekirdekte yönlendirilen ve eksprese edilen 2 μ plazmid Yep352 idi. Diğeri, COX1ΔC15 alelini artı COX1 5′ ve 3′-UTR’lerin sırasıyla 395 nt ve 990 nt’sini içeren plazmid pXPM61 idi. (C) WP’ler, mitokondriyal DNA’dan (rho0 suşu) yoksun olan NAB69 suşundan hücrelere sokuldu. Bombardıman plakalarından elde edilen transformant koloniler, nükleer plazmid YEp352’nin oksotrofik belirteci olan urasil içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı. (D) Pozitif rhokolonileri seçmek için, -URA plakası urasil içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı. Bu, pozitif kolonilerin toplandığı ve izole edildiği ana plakaydı. Ayrıca zengin ortam (YPD) ve bir test cihazı suşunun çimi olan plakalar üzerinde de çoğaltıldı. Çiftleşme sırasında, sentetik rho-mitokondriyal DNA, COX1 geninde (D369N) bir mutasyon taşıyan test edici suş L4527’den mitokondriyal DNA ile yeniden birleştirildi. Solunum ortamında büyüyen diploidler, dönüştürülmüş DNA’yı içeriyordu. Karşılık gelen koloniler, yeniden doldurmak ve saflaştırmak için ana plakadan toplandı. Tüm replika kaplama boyunca ana plakadaki pozitif kolonileri tanımlamaya yardımcı olmak için, plakaların kenarlarında kalıcı bir işaretleyici ile işaretler yapıldı (yeşil çizgiler). (E) Seçilen pozitif koloniler, urasil içermeyen bir ortam üzerinde yeniden yerleştirildi. Bu yeni ana plakaydı. D’de olduğu gibi, sentetik rhokolonileri saflaştırmak için iki tur daha test yapıldı. Kısaltmalar: WP’ler = tungsten parçacıkları; mtDNA = mitokondriyal DNA; -URA/Sorb = urasil eksikliği/ Sorbitol içeren; WT = vahşi tür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sitülasyon prosedürünü açıklayan diyagram. (A) Sitülasyon sırasında hücrelerin nasıl çiftleştiğine genel bakış. Sitoddüksiyon sırasında, donör ve alıcı suşlardan gelen mitokondri birleşir, böylece her iki suştan gelen mitokondriyal DNA yeniden birleşir. Kar1-1 mutasyonu30 nedeniyle nükleer füzyon azaldığından, binükleer zigotlar oluşur. Bir miktar inkübasyon/iyileşme süresinden sonra, amaçlanan mitokondriyal mutasyonu içeren binükleer zigot tomurcuğu ve haploid alıcıları seçilir. (B) Sentetik rho-suş (donör) ve alıcı suşun sitodüksiyon yoluyla çiftleşmesi, çiftleşme mayasının karakteristik bir şekli olan shmoos (kırmızı oklar) oluşumuna izin verir. Görüntü, 100x objektif ile ışık mikroskobu altında çekildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: COX1ΔC15 mutasyonunu mitokondriyal genoma entegre etmek için spesifik bir sitodüksiyon örneğini açıklayan diyagram. (A) Sentetik rho suşun (donör, XPM199) ve ilgilenilen suşun (alıcı, XPM10) sıvı kültürleri çiftleşmek için karıştırıldı. Shmoo oluşumundan sonra, karışım 2-4 saat boyunca sıvı bir kültürde geri kazanıldı. Daha sonra, sitodüksiyon karışımı, donör hücrelerin büyümesini önlemek için orta derecede adenin içermeyen bir plaka üzerine yayıldı. (B) Sitodüksiyon sırasında donörden (XPM199) ve alıcıdan (XPM10) mitokondriyal DNA’nın rekombinasyon olaylarının şematik gösterimi. (C) Ana plaka, amaçlanan mitokondriyal geni organelin DNA’sına entegre eden haploidleri tanımlamak ve saflaştırmak için farklı seçici ortamlarda çoğaltıldı (XPM209)25. Kısaltmalar: -ADE = adenin eksikliği; -LEU = lösin eksikliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

NOT: Mitokondriyal dönüşüm verimliliği genellikle düşük olduğu için her yapı için altı dönüşüm yapmanızı öneririz. Farklı büyüme ortamlarının bileşimi Tablo 2’de gösterilmektedir. 1. Tungsten parçacık hazırlama Bir mikrotüpte 30 mg 0.7 μm tungsten parçacıkları (WP’ler, mikro taşıyıcılar) tartın. Sterilize etmek için 1,5 mL etanol (EtOH) ekleyin. WP’leri vorteksleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika dinlen…

Representative Results

Bu bölüm, mitokondriyal dönüşümün farklı aşamalarından bazı temsili sonuçlar sunmaktadır. Şekil 6’da bir bombardıman prosedürü gösterilmektedir. Sentetik rho hücreleri, bir mitokondriyal genin kodlama dizisinin yerini alacak olan raportör gen ARG8m ile bir bakteri plazmidi taşıdı (Şekil 6A). Bombardımandan sonra, plaka urasil (-URA) içermeyen bir ortam üzerinde çoğaltıldı; bu ana plakadır </s…

Discussion

Bu çalışma, S. cerevisiae mayasından mitokondrinin nasıl başarılı bir şekilde dönüştürüleceğini açıklamıştır. Yüksek hızlı mikromermi bombardımanından amaçlanan maya suşunun saflaştırılmasına kadar olan süreç, sentetik rho-suşun kaç tur saflaştırılmasının gerekli olduğuna bağlı olarak ~ 8-12 hafta sürer. Yöntemin kritik adımlarından bazıları aşağıdaki gibidir. İlk olarak, mitokondriyal gen yapısındaki mutasyon bölgesinin etrafına eklenen yan bö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu yayın, Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M] tarafından desteklenmiştir. UPD bir CONAHCYT üyesidir (CVU:883299). Işık mikroskobu görüntüleriyle ilgili teknik yardım için Dr. Ariann Mendoza-Martínez’e teşekkür etmek istiyoruz. Biorender lisansları: DU26OMVLUU (Şekil 2); BK26TH9GXH (Şekil 3); GD26TH80R5 (Şekil 4); PU26THARYD (Şekil 7); ML26THAIFG (Şekil 9).

Materials

1 mL pipette tips Axygen T-1000-B
1.5 mL Microtube Axygen MCT-150-C
10 μL pipette tips Axygen T-10-C
15 mL conical bottom tube  Axygen SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips Axygen T-200-Y
50 mL conical bottom  tube Axygen SCT-50ML-25-S
AfiII New England BioLabs R0520S
Agarose SeaKem 50004
Analytic balance OHAUS ARA520
Autoclave TOMY ES-315
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Biolisitic Macrocarrier holder  BIO-RAD 1652322
Bunsen burner VWR 89038-528
Calcium chloride Fisher Scientific C79-500
CSM -ADE Formedium DCS0049
CSM -ARG Formedium DCS0059
CSM -LEU Formedium DCS0099
CSM -URA Formedium DCS0169
Culture glass flask KIMAX KIMBLE 25615
Culture glass tube Pyrex 9820
Dextrose BD 215520
Ethanol JT Baker  9000
Forceps Millipore 620006
Glass beads Sigma Z265926
Glass handle Sigma S4647
Glycerol JT BAKER 2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)
HSTaq  Kit PCR BIO
Microcentrifugue Eppendorf 022620100
NdeI New England BioLabs R0111L
Orbital shaker New Brunswick scientific NB-G25
PCR tubes Axygen PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System BIO-RAD 165-2257
Petri dishes (100X10) BD 252777
QIAprep Spin Miniprep Qiagen 27106
Raffinose Formedium RAF03
Replica plater Scienceware Z363391
Rupture discs 1350 Psi BIO-RAD 1652330
Sorbitol Sigma S7547
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase Thermo Scientific EL0011
Tissue Culture Rotator Thermo Scientific 88882015
Tungsten microcarriers M10 BIO-RAD 1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity
Velvet pads Bel-Art H37848-0002
Vortex  Scientifc Industries SI-0236
Wood aplicator stick PROMA 1820060
Yeast extract BD 212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids BD 291920

References

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965 (2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359 (2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), e4146 (2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. . Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144 (Pt 1), 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Cite This Article
Camacho-Villasana, Y., Pedroza-Dávila, U., Perez-Martinez, X. Mitochondrial Transformation in Baker's Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly. J. Vis. Exp. (208), e66856, doi:10.3791/66856 (2024).

View Video