تحول الميتوكوندريا في بيكر

الخميرة Saccharomyces cerevisiae هو نموذج معترف به على نطاق واسع يستخدم لدراسة التكوين الحيوي للميتوكوندريا. نظرا لأن الخميرة كائن لاهوائي اختياري ، فمن الممكن إجراء دراسة واسعة النطاق لأسباب وعواقب إدخال طفرات تضعف التنفس. بالإضافة إلى ذلك ، يمتلك هذا الكائن أدوات وراثية وكيميائية حيوية صديقة لدراسة مسارات الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن أحد أقوى الموارد لاستكشاف آليات تجميع مجمع الجهاز التنفسي وتخليق بروتين الميتوكوندريا هو القدرة على تحويل الميتوكوندريا وتعديل جينوم العضية. في السابق ، كان من المفيد إدخال طفرات في نقطة الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) أو عمليات حذف / إدراج صغيرة^{1،2،3،4،5} ، وحذف الجينات ^6,7 ، وإعادة ترتيب الجينات ^7,8 ، وإضافة حواتم إلى بروتينات الميتوكوندريا ^9,10 ، ونقل الجينات من النواة إلى الميتوكوندريا^{11 ،12} ، وإدخال جينات المراسل مثل BarStar¹³ و GFP^14,15 و luciferase¹⁶ والأكثر استخداما ARG8^{m 17,18}. سمحت لنا تعديلات جينوم الميتوكوندريا بتشريح وتحديد الآليات التي كان من الصعب فهمها لولا ذلك. على سبيل المثال ، كان جين مراسل ARG8^m الذي تم إدخاله في موضع COX1 في الحمض النووي للميتوكوندريا حاسما لفهم أن Mss51 له دور مزدوج في التكوين الحيوي Cox1. أولا ، إنه منشط متعدي ل COX1 mRNA ، وثانيا ، إنه مرافق تجميع لبروتين Cox1 المصنوع حديثا ^7,19. يقدم هذا العمل طريقة مفصلة لتحويل S. cerevisiae الميتوكوندريا. على الرغم من نشر بروتوكول تحويل الميتوكوندريا في وقت سابق^{16،20،21،22،23} ، إلا أن النهج المرئي من خلال الفيديو ضروري لفهم المراحل والتفاصيل المختلفة للطريقة بدقة. تتكون الطريقة من خطوات مختلفة وتنقسم إلى أربع مراحل عامة:

الشكل 1: نظرة عامة على إجراء تحويل الميتوكوندريا بواسطة قصف المقذوفات الدقيقة عالية السرعة: 1) يتم تعقيم جزيئات التنغستن وتحضيرها قبل طلاء الحمض النووي. 2) يتم ترسيب اثنين من البلازميدات المختلفة على سطح WPS. أحدهما عبارة عن بلازميد بكتيري يحتوي على البنية التي سيتم توجيهها إلى مصفوفة الميتوكوندريا. والآخر هو ناقل تعبير فطر الخميرة النووي الذي يحمل علامة التغذية الأكسجة. 3) تزرع سلالة خميرة مستقبلات تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا (rho⁰) على مصدر كربون مخمر مثل الجالاكتوز أو رافينوز ، والذي لا يمارس أي قمع للجلوكوز للتعبير الجيني للميتوكوندريا^34,35. تنتشر الثقافة على أطباق بتري التي تحتوي على وسط القصف. 4) يتم إطلاق WPs المغلفة بالبلازميدات على سلالة المستقبلات عن طريق قصف المقذوفات الدقيقة عالية السرعة. 5) يتم ^{اختيار مستعمرات} الرو الاصطناعية الإيجابية التي تحتوي على بلازميد الميتوكوندريا عن طريق التزاوج مع سلالة اختبار. 6) يتم دمج بنية الميتوكوندريا في جينوم الميتوكوندريا في الموضع المطلوب عن طريق تزاوج ^{سلالة الرو} الاصطناعية (المانحة) مع سلالة المستقبل من خلال عملية تعرف باسم duction الخلوي. 7) يتم اختيار المستقبل الإيجابي ، سلالة أحادية الصيغة الصبغية تحمل بنية الميتوكوندريا وتنقيتها في وسائط مختلفة. الاختصارات: WPs = جزيئات التنغستن. mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحول الخلايا ذات بنية الحمض النووي التي تهدف إلى الاندماج في جينوم الميتوكوندريا (الشكل 1 ، الخطوات 1-4)
على الرغم من أنه من الممكن تحويل الخميرة التي تحتوي على جينوم ميتوكوندريا كامل (rho ⁺) مباشرة ، إلا أن التحول يكون أكثر كفاءة بمقدار 10-20 مرة إذا كانت الخلايا تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا (rho⁰) ²⁴. جزيئات التنغستن (WPs) مغلفة ببلازميدات مختلفة سيتم تحويلها بشكل مشترك. الأول هو ناقل تعبير μ الخميرة 2 يحمل علامة auxotrophy ، مثل LEU2 أو URA3 (على سبيل المثال ، YEp351 أو YEp352 ، على التوالي). إذا نجح الإدخال البيولوجي للحمض النووي في خلايا الخميرة ، فسوف تنمو المحولات على وسط التغذية الأوكسوجينية (أي وسط يفتقر إلى الليوسين أو اليوراسيل). هذا البلازميد مفيد في إجراء الاختيار الأول للخلايا التي اكتسبت البلازميد النووي. خلاف ذلك ، فإن عدد المستعمرات الناتجة سوف يشبع اللوحة. البلازميد الثاني هو بلازميد بكتيري (مثل pBluescript أو ما شابه) يحتوي على بنية الميتوكوندريا المراد دمجها في جينوم الميتوكوندريا. يجب أن يحتوي البناء على 100 nt على الأقل من تسلسلات الميتوكوندريا المحيطة ب 5 ‘و 3’ لإعادة التركيب مع منطقة الميتوكوندريا ذات الأهمية. في تجربتنا ، من المرجح أن تتحد التسلسلات المرافقة الأكبر بنجاح مع الموضع المستهدف في جينوم الميتوكوندريا.

يظهر مثال محدد في الشكل 2²⁵. في هذا المثال ، كان الهدف هو حذف منطقة ترميز جين الميتوكوندريا COX1 لآخر 15 حمضا أمينيا للبروتين المقابل (Cox1ΔC15) (الشكل 2A). احتوت البلازميد البكتيرية التي تحمل طفرة COX1ΔC15 على 395 nt و 990 nt من مناطق الجين غير المترجمة 5 ‘و 3’ ، على التوالي. تم اشتقاق البلازميد من pBluescript (pXPM61) ، جنبا إلى جنب مع 2 μ البلازميد YEp352 ، تم نسخها على سطح WPs (الشكل 2B). ثم تم إدخال WPs عن طريق قصف المقذوفات الدقيقة في سلالة المتلقي المختارة (الشكل 2C). هذه السلالة ، المسماة NAB69²⁶ ، هي سلالة MATa ، rho⁰ تحمل أليلات kar1-1 و ade2 (تتم مناقشة أهمية هذه الخصائص أدناه). تم طلاء الخلايا على وسائط قصف تفتقر إلى اليوراسيل لاختيار تلك التي اكتسبت بلازميد 2 μ (الشكل 2C). نمت الخلايا لمدة 5-7 ليال عند 30 درجة مئوية.

اختيار الخلايا التي اكتسبت البلازميد البكتيري الذي يحتوي على بنية الميتوكوندريا والبلازميد النووي 2 μ الذي يحمل علامة التغذية auxotrophy (الشكل 1 ، الخطوة 5)
ستحتفظ المستعمرات الموجبة بالعديد من نسخ البلازميد البكتيري في الميتوكوندريا²². نظرا لأن الخلايا المحولة هي في الأصل rho⁰ ، فلا توجد تسلسلات ميتوكوندريا تدعم ترجمة بنية الميتوكوندريا الموجودة في البلازميد. ومن ثم، لن يتم التعبير عن جين الميتوكوندريا المتحول. من الضروري تزاوج المحولات مع سلالة اختبار للكشف عن مستعمرات الخميرة التي اكتسبت بلازميد الميتوكوندريا. يحتوي جينوم الميتوكوندريا لسلالة الاختبار على نسخة متحولة غير وظيفية من الجين محل الاهتمام. بعد التزاوج ، سوف تندمج الميتوكوندريا ، وسوف يتحد تسلسل الميتوكوندريا المتضمن في البلازميد المحول مع جين الميتوكوندريا المتحور من سلالة المختبر. وبالتالي ، فإن استعادة جين WT سيعيد تشكيل الوظيفة. سيكون لثنائي الصبغيات الناتج نمط ظاهري إيجابي يمكن اكتشافه (عادة ما تكون القدرة على النمو في وسط تنفسي أو وسط يفتقر إلى الأرجينين). تسمى الخلايا الإيجابية التي تحمل البلازميد البكتيري في الميتوكوندريا ^{“خلايا رو} الاصطناعية”. في المثال المحدد للشكل 2D ، كانت خلايا rho^– الاصطناعية التي تحمل بنية COX1ΔC15 (المسماة XPM199) مطلية بنسخة طبق الأصل على وسط يفتقر إلى اليوراسيل (هذه هي اللوحة الرئيسية التي تم تنقية المستعمرات الإيجابية منها). كما تم طلاؤها على نسخة طبق الأصل على سلالة اختبار L45²⁷ في الحديقة ، والتي تحتوي على الطفرة غير الوظيفية cox1D369N. بعد التزاوج لمدة ليلتين ، أعيد دمج جينوم الميتوكوندريا L45 و XPM199 ، مما أدى إلى جين COX1 وظيفي. لذلك ، استعادت ثنائيات الصبغيات القدرة على النمو على وسائط الجهاز التنفسي. من اللوحة الرئيسية ، اخترنا المستعمرات الإيجابية. تم تخطيطها على ألواح تفتقر إلى اليوراسيل ، وتكررت الاختبارات الانتقائية للحصول ^{على خلايا رو} اصطناعية نقية (الشكل 2E). من المهم ملاحظة أن لوحة الاختبار مخصصة فقط لتحديد مستعمرات ^{الرو الاصطناعية} ، ولا يمكن استرداد الطفرات من هذه اللوحات.

دمج البناء في جينوم الميتوكوندريا للسلالة المقصودة
يتم تحقيق هذه الخطوة من خلال عملية تسمى التحفيز الخلوي^28,29 (الشكل 1 ، الخطوة 6). في هذا النهج ، يتم تزاوج سلالة rho^– الاصطناعية (سلالة المانح) مع سلالة المستقبل المقصود من نوع التزاوج المعاكس. أحد المتطلبات الأساسية هو أن تحمل واحدة على الأقل من سلالتي التزاوج طفرة kar1-1 لإعاقة الاندماج النووي³⁰. ومن ثم، ينتج عن تزاوج الخليتين زيجوت ثنائي النواة (الشكل 3). تندمج شبكة الميتوكوندريا من الخلايا الأبوية (المتبرع والمستقبل) وتتحد جزيئات الحمض النووي للميتوكوندريا. يتم تحضين/استعادة الزيجوت ثنائي النواة للسماح بالتبرعم، وهو ما ينتج خلايا أحادية الصيغة الصبغية. تحمل هذه الأحاديات الصيغة الصبغية الخلفية النووية لإحدى الخلايا الأبوية. وبالمثل ، يمكن أن تحمل الأحاديات الصيغة الصبغية الحمض النووي للميتوكوندريا من الخلية الأبوية أو الحمض النووي للميتوكوندريا المعاد تجميعه محل الاهتمام. ومع ذلك ، فإن طفرة kar1-1 ليست فعالة بنسبة 100٪ ، وسيتم تشكيل بعض ثنائيات الصيغة الصبغية الحقيقية أثناء التزاوج^28,29. حملت ^{سلالة rho} الاصطناعية (المانحة ، XPM199) أليل kar1-1 في المثال. كعلامة انتقائية ، كان يحتوي على أليل ade2 ، مما يجعله تغذية أكسوفية للأدينين (الشكل 4). كانت سلالة المستقبل XPM10 ، وهي سلالة rho ⁺ تحمل بنية cox1Δ::ARG8^m ، حيث حل المراسل ARG8^m محل كودونات COX1 في جينوم الميتوكوندريا⁷. تمت إضافة خليط من كل من ثقافات الخلايا إلى لوحة YPD كقطرة للسماح بالتزاوج. بعد 3-5 ساعات ، تمت ملاحظة الخلايا تحت المجهر الضوئي للكشف عن تكوين شموس (الشكل 3 ب) ، وهو شكل خلية مرتبط بالتزاوج. بعد وقت الحضانة / الشفاء ، تم طلاء الزيجوت ثنائي النواة على وسط يفتقر إلى الأدينين لمنع نمو الخلايا المانحة.

اختيار السلالة الأحادية الصيغة الصبغية التي تحمل جينوم الميتوكوندريا محل الاهتمام (الشكل 1 ، الخطوة 7)
يوجد خليط من الخلايا المانحة والمستقبلة والخلايا الثنائية الصيغة الصبغية بعد الحث الخلوي. لذلك ، بعد حضانة / استعادة الزيجوت ثنائي النواة ، يجب أن تنمو الخلايا في وسائط انتقائية مختلفة لتحديد وتنقية الأحاديات الصيغة الصبغية ذات الأهمية. تعتمد الوسائط الانتقائية على الأنماط الجينية للمتبرع ، والسلالات المتقبلة ، وبناء الميتوكوندريا المقصود. ومع ذلك ، بشكل عام ، فإن سبب اختيار الوسائط الانتقائية هو: أ) بعد الحضانة / الشفاء ، يزرع مزيج التكاثر الخلوي على وسط انتقائي حيث لا يمكن أن تنمو سلالة الوالدين المتبرعين. في المثال المحدد في الشكل 4 أ ، ب ، يحمل المتبرع (^{سلالة rho} الاصطناعية) أليل ade2 غير الوظيفي. وبالتالي ، يجب تحضين مزيج الخلوي على صفيحة متوسطة تفتقر إلى الأدينين. هذه هي اللوحة الرئيسية. ب) بمجرد نمو المستعمرات ، يتم تكرار الصفيحة الرئيسية مرة أخرى على وسط يفتقر إلى الأدينين (لتوليد صفيحة رئيسية جديدة حيث سيتم تنقية المستعمرات الإيجابية ذات الأهمية) ، وبعد ذلك ، على وسط حيث يمكن أن تنمو ثنائيات الصيغة الصبغية فقط. هذا ضروري لتجنب المزيد من التنقية غير المقصودة للمستعمرات ثنائية الصبغية. في حالة المثال من الشكل 4C ، يمكن أن تنمو ثنائيات الصيغة الصبغية فقط على الوسائط التي تفتقر إلى الليوسين. ج) يتم تكرار اللوحة الرئيسية أيضا على الوسائط حيث ستنمو فقط تلك الأحاديات الصبغية المتقبلة التي تضمنت الحمض النووي للميتوكوندريا محل الاهتمام. في مثال الشكل 4C ، تنمو الأحاديات الصيغة الصبغية على وسط تنفسي يحتوي على الإيثانول / الجلسرين كمصدر للكربون لأن بروتين Cox1ΔC15 يعمل. تم تسمية سلالة rho ⁺ الناتجة التي تحمل mtDNA محل الاهتمام XPM209²⁵. السلالات المستخدمة في الشكل 2 والشكل 4 مذكورة في الجدول 1.

الشكل 2: شكل يصف مثالا محددا لتحول الميتوكوندريا واختيار ^خلايا الرو الموجبة. (أ) كان التعديل المقصود لجينوم الميتوكوندريا هو حذف ترميز المنطقة لآخر 15 حمضا أمينيا للوحدة الفرعية Cox1 (Cox1ΔC15). (ب) تم طلاء WPs ببلازميدين لتحويل خلايا فطر الخميرة. أحدهما كان 2 μ بلازميد Yep352 الذي تم توجيهه والتعبير عنه في النواة. والآخر كان البلازميد pXPM61 ، الذي يحتوي على أليل COX1ΔC15 بالإضافة إلى 395 nt و 990 nt من COX1 5 ‘و 3’-UTRs ، على التوالي. (ج) تم إدخال WPs في الخلايا من سلالة NAB69 ، التي تفتقر إلى الحمض النووي للميتوكوندريا (سلالة rho⁰). تم تكرار المستعمرات المحولة التي تم الحصول عليها من ألواح القصف على وسط يفتقر إلى اليوراسيل ، وهو علامة التغذية الذاتية للبلازميد النووي YEp352. (د) ^{لتحديد مستعمرات} الرو الموجبة، تضاعفت صفيحة -URA على وسط يفتقر إلى اليوراسيل. كانت هذه هي اللوحة الرئيسية التي تم اختيار المستعمرات الإيجابية منها وعزلها. كما تم تكراره على لوحات ذات وسائط غنية (YPD) وعشب من سلالة اختبار. أثناء التزاوج ، تم إعادة دمج الحمض النووي للميتوكوندريا الاصطناعية مع الحمض النووي للميتوكوندريا من سلالة الاختبار ، L45²⁷ ، والتي تحمل طفرة في جين COX1 (D369N). احتوت ثنائيات الصيغة الصبغية التي نمت على وسائط الجهاز التنفسي على الحمض النووي المحول. تم اختيار المستعمرات المقابلة من اللوحة الرئيسية لإعادة تنقيتها وتنقيتها. للمساعدة في تحديد المستعمرات الموجبة في اللوحة الرئيسية في جميع أنحاء الطلاء المتماثل ، تم عمل علامات بعلامة دائمة على حواف الألواح (الخطوط الخضراء). (ه) تم إعادة تكوين المستعمرات الموجبة المختارة على وسط يفتقر إلى اليوراسيل. كانت هذه اللوحة الرئيسية الجديدة. كما هو الحال في D ، تم إجراء جولتين أخريين من الاختبارات لتنقية ^{مستعمرات} الرو الاصطناعية. الاختصارات: WPs = جزيئات التنغستن. mtDNA = الحمض النووي للميتوكوندريا. -URA / Sorb = تفتقر إلى اليوراسيل / المحتوي على السوربيتول ؛ WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: شكل يصف إجراء التحفيز الخلوي. أ: نظرة عامة على كيفية تزاوج الخلايا أثناء التحفيز الخلوي. أثناء التحفيز الخلوي ، تندمج الميتوكوندريا من سلالات المتبرع والمستقبل بحيث يتحد الحمض النووي للميتوكوندريا من كلتا السلالتين. منذ انخفاض الاندماج النووي بسبب طفرة kar1-1 ³⁰ ، تتشكل زيجوت ثنائية النواة. بعد بعض وقت الحضانة / التعافي ، يتم اختيار برعم الزيجوت ثنائي النواة والمستقبلات أحادية الصيغة الصبغية التي تحتوي على طفرة الميتوكوندريا المقصودة. (ب) يسمح تزاوج ^{سلالة الرو} الاصطناعية (المانحة) والسلالة المستقبلة من خلال الاستقطاب الخلوي بتكوين شموس (الأسهم الحمراء) ، وهو شكل مميز لخميرة التزاوج. تم التقاط الصورة تحت المجهر الضوئي بهدف 100x. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: شكل يصف مثالا محددا للتحضير الخلوي لدمج الطفرة COX1ΔC15 في جينوم الميتوكوندريا. (أ) تم خلط الثقافات السائلة ^{لسلالة الرو} الاصطناعية (المانح ، XPM199) والسلالة محل الاهتمام (المستقبل ، XPM10) للتزاوج. بعد تشكيل shmoo ، تم استرداد المزيج في ثقافة سائلة لمدة 2-4 ساعات. بعد ذلك ، تم نشر مزيج التجويد الخلوي على طبق به وسط يفتقر إلى الأدينين لمنع نمو الخلايا المانحة. (ب) تمثيل تخطيطي لأحداث إعادة تركيب الحمض النووي للميتوكوندريا من المتبرع (XPM199) والمستقبل (XPM10) أثناء الاستنباط الخلوي. (ج) تضاعفت الصفيحة الرئيسية على وسائط انتقائية مختلفة لتحديد وتنقية تلك الأحاديات الصيغة الصبغية التي دمجت جين الميتوكوندريا المقصود في الحمض النووي للعضية (XPM209)²⁵. الاختصارات: -ADE = تفتقر إلى الأدينين ؛ -LEU = نقص الليوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.