Summary

Summary

Este trabajo explica cómo transformar las mitocondrias de la levadura utilizando un método biolístico. También mostramos cómo seleccionar y purificar los transformantes y cómo introducir la mutación deseada en la posición objetivo dentro del genoma mitocondrial.

Abstract

La levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae se ha utilizado ampliamente para comprender la biología mitocondrial durante décadas. Este modelo ha proporcionado conocimiento sobre las vías mitocondriales esenciales y conservadas entre los eucariotas y las vías específicas de hongos o levaduras. Una de las muchas habilidades de S. cerevisiae es la capacidad de manipular el genoma mitocondrial, que hasta ahora solo es posible en S. cerevisiae y el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. La transformación biolística de las mitocondrias de levadura nos permite introducir mutaciones dirigidas al sitio, hacer reordenamientos genéticos e introducir reporteros. Estos enfoques se utilizan principalmente para comprender los mecanismos de dos procesos altamente coordinados en las mitocondrias: la traducción por mitoribosomas y el ensamblaje de complejos respiratorios y ATP sintasa. Sin embargo, la transformación mitocondrial puede utilizarse potencialmente para estudiar otras vías. En el presente trabajo, mostramos cómo transformar las mitocondrias de levadura mediante bombardeo de microproyectiles a alta velocidad, seleccionar y purificar el transformador deseado e introducir la mutación deseada en el genoma mitocondrial.

Introduction

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un modelo ampliamente reconocido que se utiliza para estudiar la biogénesis mitocondrial. Dado que la levadura es un organismo anaeróbico y facultativo, es posible estudiar ampliamente las causas y consecuencias de la introducción de mutaciones que perjudican la respiración. Además, este organismo posee herramientas genéticas y bioquímicas amigables para estudiar las vías mitocondriales. Sin embargo, uno de los recursos más poderosos para explorar los mecanismos de ensamblaje del complejo respiratorio y la síntesis de proteínas mitocondriales es la capacidad de transformar las mitocondrias y modificar el genoma del orgánulo. Anteriormente, ha sido útil introducir en el ADN mitocondrial (ADNmt) mutaciones puntuales o pequeñas deleciones/inserciones 1,2,3,4,5, eliminar genes 6,7, hacer reordenamientos genéticos 7,8, agregar epítopos a las proteínas mitocondriales 9,10, reubicar genes del núcleo a las mitocondrias11,12, e introducir genes reporteros como BarStar13, GFP14,15, luciferasa16 y el ARG8m17,18 más utilizado. Las modificaciones del genoma mitocondrial nos han permitido diseccionar e identificar mecanismos que de otro modo habrían sido difíciles de comprender. Por ejemplo, el gen reportero ARG8m insertado en el locus COX1 en el ADN mitocondrial fue crucial para comprender que Mss51 tiene un doble papel en la biogénesis de Cox1. En primer lugar, es un activador traduccional del ARNm de COX1 y, en segundo lugar, es una chaperona de ensamblaje para la proteína Cox1 7,19 recién creada. En este trabajo se presenta un método detallado para transformar las mitocondrias de S. cerevisiae. A pesar de que el protocolo de transformación mitocondrial fue publicado anteriormente 16,20,21,22,23, un abordaje visual a través de un video es esencial para comprender a fondo las diferentes etapas y detalles del método. El método consta de varios pasos y se divide en cuatro etapas generales:

Figure 1
Figura 1: Descripción general del procedimiento de transformación mitocondrial por bombardeo de microproyectiles a alta velocidad: 1) Las partículas de tungsteno se esterilizan y preparan antes del recubrimiento del ADN. 2) Dos plásmidos diferentes se precipitan en la superficie de los WPs. Uno es un plásmido bacteriano que contiene la construcción que se dirigirá a la matriz mitocondrial. El otro es un vector de expresión de levadura nuclear portador de un marcador de auxotrofia. 3) Una cepa de levadura receptora que carece de ADN mitocondrial (rho0) se cultiva en una fuente de carbono fermentativo como la galactosa o la rafinosa, que no ejerce ninguna represión de la glucosa en la expresión génica mitocondrial34,35. El cultivo se propaga en placas de Petri que contienen el medio de bombardeo. 4) Los WP recubiertos con plásmidos son disparados a la cepa receptora mediante un bombardeo de microproyectiles de alta velocidad. 5) Las colonias de rho colonies sintéticas positivas que contienen el plásmido mitocondrial se seleccionan mediante el apareamiento con una cepa de prueba. 6) La construcción mitocondrial se integra en el genoma mitocondrial en el locus deseado mediante el acoplamiento de la cepa sintética (donante) con la cepa aceptora mediante un proceso conocido como citoducción. 7) El receptor positivo, cepa haploide portadora de la construcción mitocondrial, se selecciona y purifica en diferentes medios. Abreviaturas: WPs = partículas de tungsteno; ADNmt = ADN mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Transformación de células con la construcción de ADN destinada a integrarse en el genoma mitocondrial (Figura 1, pasos 1-4)
Aunque es posible transformar directamente una levadura que contiene un genoma mitocondrial completo (rho+), la transformación es 10-20 veces más eficiente si las células carecen de ADN mitocondrial (rho0)24. Las partículas de tungsteno (WP) están recubiertas con dos plásmidos diferentes que se cotransformarán. El primero es un vector de expresión de μ levadura 2 portador de un marcador de auxotrofia, como LEU2 o URA3 (por ejemplo, YEp351 o YEp352, respectivamente). Si la introducción biológica del ADN en las células de levadura tiene éxito, los transformadores crecerán en el medio auxotrofia (es decir, un medio que carece de leucina o uracilo). Este plásmido es útil para hacer la primera selección de las células que adquirieron el plásmido nuclear; De lo contrario, el número de colonias resultantes saturaría la placa. El segundo plásmido es un plásmido bacteriano (como pBluescript o similar) que contiene la construcción mitocondrial destinada a integrarse en el genoma mitocondrial. El constructo debe contener al menos 100 nt de secuencias mitocondriales flanqueantes de 5′ y 3′ para su recombinación con la región mitocondrial de interés. En nuestra experiencia, es más probable que las secuencias flanqueantes más grandes se recombinen con éxito con el locus objetivo en el genoma mitocondrial.

Un ejemplo específico se muestra en la Figura 225. En este ejemplo, el objetivo era eliminar la región del gen mitocondrial COX1 que codifica para los últimos 15 aminoácidos de la proteína correspondiente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). El plásmido bacteriano portador de la mutación COX1ΔC15 contenía 395 nt y 990 nt de las regiones no traducidas 5′ y 3′ del gen, respectivamente. El plásmido se derivó de pBluescript (pXPM61) y, junto con el plásmido 2 μ YEp352, se coprecipitaron en la superficie de los WP (Figura 2B). A continuación, los WP se introdujeron mediante bombardeo de microproyectiles en la cepa receptora seleccionada (Figura 2C). Esta cepa, denominada NAB6926, es una cepa MATa, rho0 que contiene los alelos kar1-1 y ade2 (la importancia de estas características se discute a continuación). Las células se sembraron en medios de bombardeo carentes de uracilo para seleccionar aquellas que adquirieron el plásmido 2 μ (Figura 2C). Las células se cultivaron durante 5-7 noches a 30 °C.

Selección de las células que adquirieron el plásmido bacteriano que contiene la construcción mitocondrial y el plásmido nuclear 2 μ portador del marcador de auxotrofia (Figura 1, paso 5)
Las colonias positivas mantendrán muchas copias del plásmido bacteriano en sus mitocondrias22. Dado que las células transformadas son originalmente rho0, no hay secuencias mitocondriales que apoyen la traducción de la construcción mitocondrial presente en el plásmido; por lo tanto, el gen mitocondrial transformado no se expresará. Es necesario acoplar los transformantes con una cepa probadora para detectar las colonias de levadura que adquirieron el plásmido mitocondrial. El genoma mitocondrial de la cepa de prueba contiene una versión mutada no funcional del gen de interés. Después del apareamiento, las mitocondrias se fusionarán y la secuencia mitocondrial incluida en el plásmido transformado se recombinará con el gen mitocondrial mutado de la cepa del probador; en consecuencia, la recuperación del gen WT reconstituirá la función. El diploide resultante tendrá un fenotipo positivo detectable (generalmente la capacidad de crecer en un medio respiratorio o en un medio que carezca de arginina). Las células positivas que transportan el plásmido bacteriano en las mitocondrias se denominan “células rho sintéticas”. En el ejemplo específico de la Figura 2D, las células rho sintéticas que llevaban la construcción COX1ΔC15 (llamada XPM199) se replicaron en un medio que carecía de uracilo (esta es la placa maestra a partir de la cual se purificaron las colonias positivas). También se replicaron en un césped de la cepa L4527 de la cepa de prueba, que contiene la mutación no funcional cox1D369N. Después de aparearse durante dos noches, el genoma mitocondrial de L45 y XPM199 se recombinó, lo que resultó en un gen COX1 funcional; Por lo tanto, los diploides recuperaron la capacidad de crecer en medios respiratorios. De la placa maestra, elegimos las colonias positivas. Se rayaron en placas que carecían de uracilo y se repitieron las pruebas selectivas para obtener células ro – das sintéticas puras (Figura 2E). Es importante tener en cuenta que la placa de prueba es solo para la identificación de colonias de rho sintéticas, y los mutantes no se pueden recuperar de estas placas.

Integración del constructo en el genoma mitocondrial de la cepa prevista
Este paso se logra mediante un proceso llamado citoducción28,29 (Figura 1, paso 6). En este enfoque, la cepa ro sintética (cepa donante) se acopla a la cepa aceptora prevista del tipo de apareamiento opuesto. Un requisito esencial es que al menos una de las dos cepas de apareamiento sea portadora de la mutación kar1-1 para impedir la fusión nuclear30. Por lo tanto, el apareamiento de las dos células produce un cigoto binucleado (Figura 3). La red mitocondrial de las células parentales (donante y aceptor) se fusiona y las moléculas de ADN mitocondrial se recombinan. Los cigotos binucleados se incuban/recuperan para permitir la gemación, que producirá células haploides. Estos haploides llevan el fondo nuclear de una de las células parentales. De manera similar, los haploides pueden transportar el ADN mitocondrial de la célula parental o del ADN mitocondrial recombinado de interés. Sin embargo, la mutación kar1-1 no es 100% efectiva, y algunos diploides verdaderos se formarán durante el apareamiento 28,29. La cepa sintética (donante, XPM199) portaba el alelo kar1-1 en el ejemplo. Como marcador selectivo, presentaba el alelo ade2, lo que lo convierte en un auxótrofo de la adenina (Figura 4). La cepa aceptora fue XPM10, una cepa rho+ portadora de la construcción cox1Δ::ARG8m, donde el reporte ARG8m reemplazó a los codones COX1 en el genoma mitocondrial7. La mezcla de ambos cultivos celulares se añadió a una placa YPD como gota para permitir el apareamiento. Después de 3-5 h, las células se observaron bajo un microscopio óptico para detectar la formación de shmoos (Figura 3B), una forma celular asociada con el apareamiento. Después del tiempo de incubación/recuperación, los cigotos binucleares se sembraron en un medio que carecía de adenina para evitar el crecimiento de las células donantes.

Selección de la cepa haploide portadora del genoma mitocondrial de interés (Figura 1, paso 7)
Después de la citoducción hay una mezcla de células donantes, aceptoras y diploides. Por lo tanto, después de la incubación/recuperación de los cigotos binucleados, las células deben cultivarse en diferentes medios selectivos para identificar y purificar los haploides de interés. Los medios selectivos dependen de los genotipos del donante, las cepas aceptoras y la construcción mitocondrial prevista. Sin embargo, en general, el razonamiento para elegir el medio selectivo es: i) después de la incubación/recuperación, la mezcla de citoducción se cultiva en un medio selectivo donde la cepa parental donante no puede crecer. En el ejemplo específico de la Figura 4A,B, el donante (cepa sintética) es portador del alelo ade2 no funcional. Por lo tanto, la mezcla de citoducción debe incubarse en una placa mediana que carezca de adenina. Esta es la placa maestra. ii) Una vez que las colonias crecen, la placa maestra se replica nuevamente en un medio que carece de adenina (para generar una nueva placa maestra a partir de donde se purificarán las colonias positivas de interés), y a continuación, en un medio donde solo pueden crecer diploides. Esto es necesario para evitar una mayor purificación inadvertida de las colonias diploides. En el caso del ejemplo de la Figura 4C, solo los diploides pueden crecer en medios que carecen de leucina. iii) La placa maestra también se replica en medios donde solo crecerán aquellos haploides aceptores que incorporaron el ADN mitocondrial de interés. En el ejemplo de la Figura 4C, los haploides crecen en medios respiratorios que contienen etanol/glicerol como fuente de carbono, ya que la proteína Cox1ΔC15 es funcional. La cepa rho+ resultante que contiene el ADNmt de interés se denominó XPM20925. Las cepas utilizadas en la Figura 2 y la Figura 4 se enumeran en la Tabla 1.

Figure 2
Figura 2: Diagrama que describe un ejemplo específico de transformación mitocondrial y selección de células rho positivas. (A) La modificación prevista del genoma mitocondrial fue una deleción de la región que codifica los últimos 15 aminoácidos de la subunidad Cox1 (Cox1ΔC15). (B) Los WP se recubrieron con dos plásmidos para transformar las células de levadura. Uno de ellos fue el plásmido de 2 μ Yep352 que se dirigió y expresó en el núcleo. El otro fue el plásmido pXPM61, que contiene el alelo COX1ΔC15 más 395 nt y 990 nt de las COX1 5′ y 3′-UTRs, respectivamente. (C) Los WP se introdujeron en células de la cepa NAB69, que carece de ADN mitocondrial (cepa rho0). Las colonias transformantes obtenidas de las placas de bombardeo se replicaron en un medio que carecía de uracilo, el marcador auxotrófico del plásmido nuclear YEp352. (D) Para seleccionar las colonias de rho positivas, se replicó la placa -URA en un medio que carecía de uracilo. Esta era la placa maestra de la que se recogían y aislaban las colonias positivas. También se replicó en placas con medios enriquecidos (YPD) y un césped de una cepa de prueba. Durante el apareamiento, el ADN romomitocondrial sintético se recombinó con el ADN mitocondrial de la cepa de prueba, L4527, que porta una mutación en el gen COX1 (D369N). Los diploides que crecían en los medios respiratorios contenían el ADN transformado. Las colonias correspondientes se recogían de la placa maestra para refrescarlas y purificarlas. Para ayudar a identificar las colonias positivas en la placa maestra a lo largo de todas las réplicas de placas, se hicieron marcas con un marcador permanente en los bordes de las placas (líneas verdes). (E) Las colonias positivas seleccionadas se volvieron a rayar en un medio que carecía de uracilo. Esta era la nueva placa maestra. Al igual que en D, se llevaron a cabo dos rondas más de pruebas para purificar las colonias de rho sintéticas. Abreviaturas: WPs = partículas de tungsteno; ADNmt = ADN mitocondrial; -URA/Sorb = sin uracilo/ que contiene Sorbitol; WT = tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama que describe el procedimiento de citoducción. (A) Descripción general de cómo se aparean las células durante la citoducción. Durante la citoducción, las mitocondrias de las cepas donante y aceptora se fusionan para que el ADN mitocondrial de ambas cepas se recombine. Dado que la fusión nuclear se reduce debido a la mutación kar1-1 30, se forman cigotos binucleares. Después de un tiempo de incubación/recuperación, se seleccionan los cigotos binucleares y los aceptores haploides que contienen la mutación mitocondrial prevista. (B) El apareamiento de la cepa sintética (donante) y la cepa aceptora a través de la citoducción permite la formación de shmoos (flechas rojas), una forma característica de la levadura de apareamiento. La imagen fue tomada bajo un microscopio óptico con un objetivo de 100x. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diagrama que describe un ejemplo específico de citoducción para integrar la mutación COX1ΔC15 en el genoma mitocondrial. (A) Se mezclaron cultivos líquidos de la cepa sintética rho (donante, XPM199) y la cepa de interés (aceptor, XPM10) para aparearse. Después de la formación de shmoo, la mezcla se recuperó en un cultivo líquido durante 2-4 h. A continuación, la mezcla de citoducción se extendió en una placa con un medio que carecía de adenina para evitar el crecimiento de las células donantes. (B) Representación esquemática de los eventos de recombinación del ADN mitocondrial del donante (XPM199) y del aceptor (XPM10) durante la citoducción. (C) La placa maestra se replicó en diferentes medios selectivos para identificar y purificar aquellos haploides que integraban el gen mitocondrial previsto en el ADN del orgánulo (XPM209)25. Abreviaturas: -ADE = falta adenina; -LEU = falta de leucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

NOTA: Recomendamos realizar seis transformaciones para cada constructo, ya que la eficiencia de la transformación mitocondrial suele ser baja. La composición de los diferentes medios de crecimiento se muestra en la Tabla 2. 1. Preparación de partículas de tungsteno Pesar 30 mg de partículas de tungsteno de 0,7 μm (WP, microportadores) en un microtubo. Añadir 1,5 mL de etanol al 70% (EtOH) para esterilizar. Agita los WP y déjalos reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 13.200 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los WP añadiendo 1,5 mL de agua estéril a las partículas, vórticándolas y centrifugando a 13.200 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Añadir 500 μL de glicerol estéril al 50% (la concentración final es de 60 μg de WPs/μL).NOTA: Los WP pueden almacenarse a -20 °C durante al menos 6 meses. De este caldo, se toma la cantidad necesaria para seis transformaciones (100 μL). 2. Recubrimiento de ADN WP Añadir 5 μg del plásmido de 2 μ y 15 μg del plásmido bacteriano que contiene la secuencia mitocondrial a un microtubo en hielo.NOTA: El volumen final no debe exceder los 50 μL para evitar diluir aún más los reactivos necesarios para el recubrimiento del ADN. Añadir 100 μL de la suspensión WP y el vórtice durante 5 s (6 mg de WPs). Añadir 4 μL de espermidina 1 M. Breve vórtice. Añadir 100 μL de CaCl2 2,5 M helado, brevemente en vórtice. Incubar en hielo durante 10 min; Agita brevemente la mezcla cada 3 min.NOTA: La solución de CaCl2 está esterilizada por filtro y no debe esterilizarse en autoclave. Centrifugar los WP durante 30 s a 13.200 × g a 4 °C y desechar el sobrenadante. Lave las partículas resuspendiéndolas suavemente en 200 μL de EtOH al 100% a -20 °C. Centrifugar los WP durante 30 s a 13.200 × g a 4 °C y desechar el sobrenadante. Repite el lavado. Vuelva a suspender los WP en 60-70 μL de EtOH 100% a temperatura ambiente con una punta de pipeta; No haga vórtice.NOTA: Para garantizar la calidad de los plásmidos, el recubrimiento de ADN debe realizarse el mismo día que la transformación biológica. 3. Preparación de materiales biológicos Antes del bombardeo, esterilice seis soportes de macroportadores (Figura 5) en un autoclave y séquelos completamente. Alternativamente, sumérjalos en EtOH y esterilícelos con una llama con la ayuda de pinzas. Colócalos en un plato de vidrio estéril. Durante la precipitación del ADN (10 minutos de incubación en hielo en el paso 2.4), inserte seis macroportadores (o discos voladores) en cada uno de los seis soportes de macroportadores con la ayuda de pinzas estériles.NOTA: No esterilice los macroportadores. Mezcle los WP recubiertos de ADN con la pipeta. Añadir 10 μL de los WP a cada superficie del macroportador y distribuir por toda la superficie con la punta de la pipeta. Si es necesario, agregue algunos microlitros adicionales de 100% EtOH a la superficie del macroportador para hacer una distribución uniforme de los WP. Deje que la suspensión se seque a temperatura ambiente durante ~ 20 min. 4. Preparación de células de levadura y placas de bombardeo Inocular la cepa del receptor rho0 en 2 mL de medio YPR (Tabla 2). Cultivar durante una noche a 30 °C en una rueda giratoria. Diluir 300 μL del cultivo en 30 mL de medio YPR fresco. Cultivar a 30 °C y 200 rpm en un agitador rotativo durante dos noches hasta que el cultivo esté saturado. Centrifugar las células de levadura a 600 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células de levadura en 600 μL de medio YPD (Tabla 2). Con un mango de vidrio estéril, extienda 100 μL de la suspensión de células de levadura en una placa sólida de medio de bombardeo.NOTA: El medio de bombardeo debe carecer del marcador de selección del plásmido de 2 μ que se utilizará para la transformación. Repita el paso 4.4 para los otros cinco platos. Incube durante 1-3 h a temperatura ambiente antes del bombardeo para asegurarse de que el medio líquido se absorba completamente en la superficie de la placa. 5. Generación de una cepa sintética por transformación biológica NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de leer el manual del usuario del equipo biológico. Describiremos el protocolo de los equipos referenciados (Tabla de Materiales y Figura 5). Limpie la cámara del sistema de suministro de partículas biológicas con etanol al 70% para evitar la contaminación y déjela reposar durante al menos 10 minutos. Justo antes del bombardeo, limpie la superficie con una toalla de papel limpia. Abra las válvulas del tanque de helio para ajustar alrededor de 2,000 psi. Encienda el equipo y encienda la fuente de vacío. Con pinzas, coloque el macroportador boca abajo en el soporte del macroportador.NOTA: No utilice la pantalla de parada que viene con el equipo. Enrosque la tapa del macroportador en la parte superior del macroportador. Todas las partes juntas constituyen el sistema de lanzamiento de microportadores (Figura 5). Coloque el sistema de lanzamiento de microportadores dentro de la cámara de vacío en el quinto nivel desde la parte inferior. Coloque una de las placas que contienen el césped de cepa rho0 en el segundo nivel desde el fondo de la cámara. Asegúrese de que el plato esté hacia arriba y sin la tapa. Con pinzas estériles, coloque un disco de ruptura en la tapa de retención. Enrosque la tapa de retención en el tubo de aceleración; Asegúrese de que la tapa de retención esté ajustada.NOTA: No tratar los discos rotos con isopropanol como se sugiere en el manual ya que hemos observado que la eficiencia de transformación disminuye. Cierre la puerta de la cámara de vacío. Coloque el interruptor VAC/VENT/HOLD en la posición VAC . Cuando se alcance un vacío de 25-28 inHg , cambie el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición HOLD .NOTA: Tenga en cuenta que el vacío alcanzable puede variar según el nivel del mar. Encontramos éxito alcanzando 25 inHg. Presione el interruptor FIRE para disparar los WP. Espere a que la presión se acumule en el tubo de aceleración hasta que alcance los 1,300 psi, momento en que el disco de ruptura se romperá, haciendo un sonido de estallido. Inmediatamente después de que se rompe el disco de ruptura, el interruptor FIRE y el vacío se liberan cambiando el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición VENT . Con cuidado, con pinzas estériles, retire cualquier residuo del disco de ruptura presente en la superficie de la placa y cubra la placa con su tapa. Repita el procedimiento para las cinco placas restantes, colocando un nuevo disco de ruptura y un macroportador en cada ronda. Al final, cierre la válvula principal del tanque de helio. Cierre la cámara y construya un vacío llevando el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición VAC . Libere el sistema de cualquier presión de helio presionando y soltando el interruptor FIRE varias veces. Repita con la puerta abierta. Apague la bomba de vacío y el equipo de bombardeo. Limpie el sistema de suministro con 70% de EtOH. Lave los soportes del macroportador con una solución SDS al 0,1%; enjuague con agua destilada estéril y 100% EtOH. 6. Selección de colonias de rho sintéticas Incubar las placas de bombardeo durante 5-7 noches a 30 °C.NOTA: Es importante revisar las placas diariamente para ver si están contaminadas. Si es necesario, la región contaminada se puede cortar con una espátula estéril para evitar una mayor contaminación. Inocular la cepa de prueba del tipo de apareamiento opuesto en 2 mL de medio YPD durante la noche (vea el ejemplo específico en la Figura 2D, E). Inocular 150 μL del cultivo de cepa del probador en una placa YPD. Con un mango de vidrio estéril, extienda el probador de manera uniforme sobre la superficie de la placa. Deje que el plato se seque durante al menos 5 minutos. Haz réplicas de las placas de bombardeo usando almohadillas de terciopelo y un sello de réplica.Se replica en una placa de medio de abandono correspondiente al marcador de auxotrofia plasmídica 2 μ transformado. El crecimiento requiere una incubación nocturna a 30 °C. Después, conservar a 4 °C hasta su nuevo uso. Esta placa es la placa maestra. Replique en la placa YPD que contiene el césped del probador del paso 6.3. Incubar a 30 °C durante dos noches. Posteriormente, replicar esta placa en el medio selectivo para detectar la presencia del gen mitocondrial de interés, por ejemplo, un medio respiratorio o un medio que carezca de arginina, e incubar durante la noche a 30 °C. Solo las células que albergaban el plásmido bacteriano sintético en las mitocondrias crecerán en el medio selectivo después de aparearse con la cepa de prueba. Identifique en la placa maestra (paso 6.4.1) las colonias correspondientes que crecieron en el paso 6.4.2.NOTA: Dado que la placa de bombardeo (y, por lo tanto, la placa maestra) está llena de colonias transformantes, puede ser difícil identificar las colonias positivas observadas en la placa de acoplamiento del probador. Por esta razón, es muy recomendable dibujar un par de líneas pequeñas a cada lado de todas las placas con un rotulador permanente. Dibuja líneas similares en el anillo de la estampilla replicante. Estas líneas serán útiles para orientar y ubicar colonias positivas en la placa maestra (vea el ejemplo en la Figura 2D). Purifique las colonias positivas pasándolas de la placa maestra a una segunda placa de abandono selectivo, como en el paso 6.4.1. Incubar durante dos noches a 30 °C.NOTA: Es esencial que el rayado permita el crecimiento de colonias individuales para asegurar una cepa pura. Repita el proceso de selección (pasos 6.2-6.5) para confirmar la presencia del plásmido bacteriano en las mitocondrias.NOTA: Por lo general, este proceso se puede repetir dos veces más para seleccionar cepas sintéticas estables. Una vez que la cepa sintética mantiene de manera estable el ADN plasmídico en las mitocondrias, seleccione de 3 a 5 colonias positivas diferentes e inocule en 2 mL de YPD. Utilice este cultivo para preparar un stock criovial (mezclando 600 μL de cultivo y 600 μL de glicerol al 50% para conservar a -70 °C) e inserte la secuencia de plásmido en el ADNmt de interés por citoducción (paso 6.7).NOTA: Dado que no hay presión selectiva para mantener el plásmido transformado en las mitocondrias a partir de la cepa sintética, el plásmido puede perderse fácilmente. Por lo tanto, recomendamos realizar la citoducción lo antes posible. 7. Integración de la construcción presente en la cepa sintética en el sitio objetivo en el genoma mitocondrial por citoducción Inocular dos tubos con 3 mL de medio YPD, uno con las células donantes (rho-cells sintéticos) y otro con las células aceptoras (celda de levadura donde se espera la construcción final). Incubar durante la noche a 30 °C. Mezclar 750 μL de la cepa donante y 250 μL de la cepa receptora en un microtubo estéril (proporción 3:1). Centrifugar la mezcla durante 1 min a 13.200 × g; Deseche el sobrenadante. Con una punta de pipeta de 1 ml con el extremo cortado, tome una gota del pellet de celda y colóquela en una placa YPD. Incubar a 30 °C durante 2-4 h.NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, no coloque más de dos suspensiones celulares en una sola placa (vea el ejemplo en la Figura 4A). Tome una pequeña cantidad de la mezcla de células, vuelva a suspenderla en 15 μL de agua estéril en un portaobjetos y coloque un cubreobjetos. Compruebe bajo un microscopio óptico la presencia de shmoos con un objetivo de 40x o 100x; esta forma característica aparece cuando hay dos tipos de apareamiento presentes (Figura 3B). Si hay shmoos, vuelva a suspender una pequeña cantidad (~0,5 mm3) de la masa celular en 2 ml de medio YPD. Incubar durante 2 h a 30 °C en una rueda giratoria para permitir que los cigotos binucleares se recuperen. Agitar la mezcla y diluir 10 μL de la suspensión celular en 990 μL de agua estéril (dilución 1:100). Utilice perlas de vidrio o un mango de vidrio estéril para esparcir 100 μL de la dilución celular en un medio de caída donde solo crece la cepa aceptora (y los diploides esporádicos). Incubar durante 2-3 noches a 30 °C. Replicar las colonias resultantes en los medios selectivos necesarios como se explica en la introducción (etapa 4; ver Figura 4C para un ejemplo específico). Después de la identificación de las colonias positivas, vuelva a colocarlas en el mismo medio selectivo para purificar la cepa haploide que lleva el ADNmt de interés. Seleccione al menos dos colonias positivas y cultívelas en 2 mL de medio YPD a 30 °C durante la noche. Haga una copia de seguridad criogénica mezclando 600 μL de glicerol al 50% con 600 μL del cultivo saturado de YPD. Conservar a -70 °C. Aislar el ADN de las cepas resultantes 31,32. Amplificar la región deseada por PCR y secuenciar para confirmar la presencia de la mutación mitocondrial.NOTA: Cada colonia positiva es una réplica técnica que debe ser confirmada de forma independiente para asegurar la secuencia correcta en el genoma mitocondrial.

Representative Results

En esta sección se presentan algunos resultados representativos de las diferentes etapas de la transformación mitocondrial. La figura 6 muestra un procedimiento de bombardeo. Las células rho- sintéticas portaban un plásmido bacteriano con el gen reportero ARG8m, que reemplazará la secuencia codificante de un gen mitocondrial (Figura 6A). Después del bombardeo, la placa se replicó en un medio que carecía de uracilo (-URA); …

Discussion

El presente trabajo describe cómo transformar con éxito las mitocondrias de la levadura S. cerevisiae . El proceso, desde el bombardeo de microproyectiles a alta velocidad hasta la purificación de la cepa de levadura prevista, dura ~ 8-12 semanas, dependiendo de cuántas rondas de purificación de la cepa sintética sean necesarias. Algunos de los pasos críticos del método son los siguientes. En primer lugar, cuanto más grandes sean las regiones flanqueantes añadidas alrededor del sitio de la m…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta publicación contó con el apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. La UPD es becaria de CONAHCYT (CVU:883299). Queremos agradecer a la Dra. Ariann Mendoza-Martínez por su ayuda técnica con las imágenes del microscopio óptico. Licencias de Biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

Materials

1 mL pipette tips Axygen T-1000-B
1.5 mL Microtube Axygen MCT-150-C
10 μL pipette tips Axygen T-10-C
15 mL conical bottom tube  Axygen SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips Axygen T-200-Y
50 mL conical bottom  tube Axygen SCT-50ML-25-S
AfiII New England BioLabs R0520S
Agarose SeaKem 50004
Analytic balance OHAUS ARA520
Autoclave TOMY ES-315
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Biolisitic Macrocarrier holder  BIO-RAD 1652322
Bunsen burner VWR 89038-528
Calcium chloride Fisher Scientific C79-500
CSM -ADE Formedium DCS0049
CSM -ARG Formedium DCS0059
CSM -LEU Formedium DCS0099
CSM -URA Formedium DCS0169
Culture glass flask KIMAX KIMBLE 25615
Culture glass tube Pyrex 9820
Dextrose BD 215520
Ethanol JT Baker  9000
Forceps Millipore 620006
Glass beads Sigma Z265926
Glass handle Sigma S4647
Glycerol JT BAKER 2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)
HSTaq  Kit PCR BIO
Microcentrifugue Eppendorf 022620100
NdeI New England BioLabs R0111L
Orbital shaker New Brunswick scientific NB-G25
PCR tubes Axygen PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System BIO-RAD 165-2257
Petri dishes (100X10) BD 252777
QIAprep Spin Miniprep Qiagen 27106
Raffinose Formedium RAF03
Replica plater Scienceware Z363391
Rupture discs 1350 Psi BIO-RAD 1652330
Sorbitol Sigma S7547
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase Thermo Scientific EL0011
Tissue Culture Rotator Thermo Scientific 88882015
Tungsten microcarriers M10 BIO-RAD 1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity
Velvet pads Bel-Art H37848-0002
Vortex  Scientifc Industries SI-0236
Wood aplicator stick PROMA 1820060
Yeast extract BD 212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids BD 291920

Referencias

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Camacho-Villasana, Y., Pedroza-Dávila, U., Perez-Martinez, X. Mitochondrial Transformation in Baker's Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly. J. Vis. Exp. (208), e66856, doi:10.3791/66856 (2024).

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