Summary

Transformação mitocondrial em Baker

Published: June 07, 2024
doi:

Summary

Este trabalho explica como transformar mitocôndrias de levedura usando um método biolístico. Também mostramos como selecionar e purificar os transformantes e como introduzir a mutação desejada na posição alvo dentro do genoma mitocondrial.

Abstract

A levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada para entender a biologia mitocondrial há décadas. Este modelo forneceu conhecimento sobre vias mitocondriais essenciais e conservadas entre eucariotos e fungos ou vias específicas de leveduras. Uma das muitas habilidades de S. cerevisiae é a capacidade de manipular o genoma mitocondrial, o que até agora só é possível em S. cerevisiae e na alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. A transformação biolística das mitocôndrias de levedura nos permite introduzir mutações dirigidas ao local, fazer rearranjos genéticos e introduzir repórteres. Essas abordagens são usadas principalmente para entender os mecanismos de dois processos altamente coordenados nas mitocôndrias: tradução por mitorribossomos e montagem de complexos respiratórios e ATP sintase. No entanto, a transformação mitocondrial pode potencialmente ser usada para estudar outras vias. No presente trabalho, mostramos como transformar mitocôndrias de leveduras por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade, selecionar e purificar o transformante pretendido e introduzir a mutação desejada no genoma mitocondrial.

Introduction

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um modelo amplamente reconhecido usado para estudar a biogênese mitocondrial. Como a levedura é um organismo anaeróbico e facultativo, é possível estudar extensivamente as causas e consequências da introdução de mutações que prejudicam a respiração. Além disso, este organismo possui ferramentas genéticas e bioquímicas amigáveis para estudar as vias mitocondriais. No entanto, um dos recursos mais poderosos para explorar os mecanismos de montagem de complexos respiratórios e síntese de proteínas mitocondriais é a capacidade de transformar as mitocôndrias e modificar o genoma da organela. Anteriormente, foi útil introduzir no DNA mitocondrial (mtDNA) mutações pontuais ou pequenas deleções / inserções 1,2,3,4,5, excluir genes 6,7, fazer rearranjos gênicos 7,8, adicionar epítopos às proteínas mitocondriais 9,10, realocar genes do núcleo para a mitocôndria11,12, e introduzir genes repórter como BarStar13, GFP14,15, luciferase16 e o ARG8m17,18 mais amplamente utilizado. As modificações do genoma mitocondrial nos permitiram dissecar e identificar mecanismos que, de outra forma, seriam difíceis de compreender. Por exemplo, o gene repórter ARG8 m inserido no locus COX1 no DNA mitocondrial foi crucial para entender que o Mss51 tem um papel duplo na biogênese de Cox1. Primeiro, é um ativador translacional do mRNA de COX1 e, segundo, é um acompanhante de montagem paraa proteína Cox1 7,19 recém-produzida. Este trabalho apresenta um método detalhado para transformar as mitocôndrias de S. cerevisiae. Embora o protocolo de transformação mitocondrial tenha sido publicado anteriormente 16,20,21,22,23, uma abordagem visual por meio de um vídeo é essencial para entender completamente as diferentes etapas e detalhes do método. O método consiste em várias etapas e é dividido em quatro etapas gerais:

Figure 1
Figura 1: Visão geral do procedimento de transformação mitocondrial por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade: 1) As partículas de tungstênio são esterilizadas e preparadas antes do revestimento de DNA. 2) Dois plasmídeos diferentes são precipitados na superfície dos WPs. Um deles é um plasmídeo bacteriano contendo a construção que será direcionada para a matriz mitocondrial. O outro é um vetor de expressão de levedura nuclear que carrega um marcador de auxotrofia. 3) Uma cepa de levedura receptora sem DNA mitocondrial (rho0) é cultivada em uma fonte de carbono fermentativa como galactose ou rafinose, que não exerce nenhuma repressão de glicose da expressão gênica mitocondrial34,35. A cultura é espalhada em placas de Petri contendo o meio de bombardeio. 4) WPs revestidos com plasmídeos são disparados para a cepa do receptor por bombardeio de microprojéteis de alta velocidade. 5) Colônias de rho sintéticas positivas contendo o plasmídeo mitocondrial são selecionadas por acoplamento a uma cepa de teste. 6) A construção mitocondrial é integrada ao genoma mitocondrial no locus desejado, acasalando a cepa sintética (doador) com a cepa aceptora por um processo conhecido como citodção. 7) O receptor positivo, cepa haplóide que carrega a construção mitocondrial, é selecionado e purificado em diferentes meios. Abreviaturas: WPs = partículas de tungstênio; mtDNA = DNA mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Transformação de células com a construção de DNA destinada a se integrar ao genoma mitocondrial (Figura 1, etapas 1-4)
Embora seja possível transformar diretamente uma levedura contendo um genoma mitocondrial completo (rho +), a transformação é 10-20 vezes mais eficiente se as células não tiverem DNA mitocondrial (rho0) 24 . As partículas de tungstênio (WPs) são revestidas com dois plasmídeos diferentes que serão cotransformados. O primeiro é um vetor de expressão μ levedura 2 que carrega um marcador de auxotrofia, como LEU2 ou URA3 (por exemplo, YEp351 ou YEp352, respectivamente). Se a introdução biolística de DNA nas células de levedura for bem-sucedida, os transformantes crescerão no meio de auxotrofia (ou seja, um meio sem leucina ou uracila). Este plasmídeo é útil para fazer a primeira seleção das células que adquiriram o plasmídeo nuclear; caso contrário, o número de colônias resultantes saturaria a placa. O segundo plasmídeo é um plasmídeo bacteriano (como pBluescript ou similar) contendo a construção mitocondrial destinada a ser integrada ao genoma mitocondrial. A construção deve conter pelo menos 100 nt de sequências mitocondriais flanqueadoras de 5′ e 3′ para recombinação com a região mitocondrial de interesse. Em nossa experiência, sequências flanqueadoras maiores têm maior probabilidade de se recombinar com sucesso com o locus alvo no genoma mitocondrial.

Um exemplo específico é mostrado na Figura 225. Neste exemplo, o objetivo era excluir a região do gene mitocondrial COX1 que codifica os últimos 15 aminoácidos da proteína correspondente (Cox1ΔC15) (Figura 2A). O plasmídeo bacteriano portador da mutação COX1ΔC15 continha 395 nt e 990 nt das regiões 5 ‘e 3’ não traduzidas do gene, respectivamente. O plasmídeo foi derivado do pBluescript (pXPM61) e, juntamente com o plasmídeo de 2 μ YEp352, foram coprecipitados na superfície dos WPs (Figura 2B). Os WPs foram então introduzidos por bombardeio de microprojéteis na cepa receptora selecionada (Figura 2C). Esta cepa, denominada NAB6926, é uma cepa MATa, rho0 com os alelos kar1-1 e ade2 (a importância dessas características é discutida abaixo). As células foram plaqueadas em meios de bombardeio sem uracila para selecionar aquelas que adquiriram o plasmídeo de 2 μ (Figura 2C). As células foram cultivadas por 5-7 noites a 30 °C.

Seleção das células que adquiriram o plasmídeo bacteriano contendo a construção mitocondrial e o plasmídeo nuclear 2 μ carregando o marcador de auxotrofia (Figura 1, etapa 5)
As colônias positivas manterão muitas cópias do plasmídeo bacteriano em suas mitocôndrias22. Como as células transformadas são originalmente rho0, nenhuma sequência mitocondrial suporta a tradução da construção mitocondrial presente no plasmídeo; portanto, o gene mitocondrial transformado não será expresso. É necessário acoplar os transformantes com uma cepa de teste para detectar as colônias de leveduras que adquiriram o plasmídeo mitocondrial. O genoma mitocondrial da cepa testadora contém uma versão mutada não funcional do gene de interesse. Após o acasalamento, as mitocôndrias se fundirão e a sequência mitocondrial incluída no plasmídeo transformado se recombinará com o gene mitocondrial mutado da cepa testadora; consequentemente, a recuperação do gene WT reconstituirá a função. O diplóide resultante terá um fenótipo positivo detectável (geralmente a capacidade de crescer em meio respiratório ou um meio sem arginina). As células positivas que carregam o plasmídeo bacteriano nas mitocôndrias são denominadas “células rho sintéticas”. No exemplo específico da Figura 2D, as células rho sintéticas portadoras da construção COX1ΔC15 (denominadas XPM199) foram replicadas em um meio sem uracila (esta é a placa mestra da qual as colônias positivas foram purificadas). Eles também foram replicados em um gramado da cepa de teste L4527, que contém a mutação não funcional cox1D369N. Após o acasalamento por duas noites, o genoma mitocondrial de L45 e XPM199 se recombinou, resultando em um gene COX1 funcional; portanto, os diplóides recuperaram a capacidade de crescer em meios respiratórios. Da placa mestra, escolhemos as colônias positivas. Eles foram listrados em placas sem uracila, e os testes seletivos foram repetidos para obter células rho sintéticas puras (Figura 2E). É importante notar que a placa de teste é apenas para a identificação de colônias de rho sintéticas, e os mutantes não podem ser recuperados dessas placas.

Integração da construção no genoma mitocondrial da cepa pretendida
Essa etapa é alcançada por um processo denominado citodução28,29 (Figura 1, etapa 6). Nesta abordagem, a cepa sintética (cepa doadora) é acoplada à cepa receptora pretendida do tipo de acasalamento oposto. Um requisito essencial é que pelo menos uma das duas cepas de acasalamento carregue a mutação kar1-1 para impedir a fusão nuclear30. Assim, o acasalamento das duas células produz um zigoto binucleado (Figura 3). A rede mitocondrial das células parentais (doador e aceitador) se funde e as moléculas de DNA mitocondrial se recombinam. Os zigotos binucleados são incubados/recuperados para permitir o brotamento, que produzirá células haplóides. Esses haplóides carregam o fundo nuclear de uma das células parentais. Da mesma forma, os haplóides podem transportar o DNA mitocondrial da célula parental ou do DNA mitocondrial recombinado de interesse. No entanto, a mutação kar1-1 não é 100% eficaz, e alguns diplóides verdadeiros serão formados durante o acasalamento28,29. A cepa sintética de rho (doador, XPM199) carregava o alelo kar1-1 no exemplo. Como marcador seletivo, apresentava o alelo ade2, tornando-se um auxotrófico para adenina (Figura 4). A cepa aceptora foi XPM10, uma cepa rho+ com a construção cox1Δ::ARG8m, onde o repórter ARG8m substituiu os códons COX1 no genoma mitocondrial7. A mistura de ambas as culturas de células foi adicionada a uma placa YPD como uma gota para permitir o acasalamento. Após 3-5 h, as células foram observadas ao microscópio óptico para detectar a formação de shmoos (Figura 3B), uma forma celular associada ao acasalamento. Após o tempo de incubação/recuperação, os zigotos binucleares foram plaqueados em meio sem adenina para evitar o crescimento das células doadoras.

Seleção da cepa haploide que carrega o genoma mitocondrial de interesse (Figura 1, etapa 7)
Uma mistura de células doadoras, aceptoras e diplóides está presente após a citação. Portanto, após a incubação/recuperação dos zigotos binucleados, as células devem ser cultivadas em diferentes meios seletivos para identificar e purificar os haplóides de interesse. O meio seletivo depende dos genótipos do doador, das cepas aceitadoras e da construção mitocondrial pretendida. No entanto, em geral, o raciocínio para a escolha do meio seletivo é: i) após a incubação/recuperação, a mistura de citodução é cultivada em meio seletivo onde a cepa parental do doador não pode crescer. No exemplo específico da Figura 4A, B, o doador (cepa sintética de rho) carrega o alelo ade2 não funcional. Assim, a mistura de citoducção deve ser incubada em uma placa média sem adenina. Esta é a placa mestra. ii) Uma vez que as colônias crescem, a placa mestra é replicada novamente em um meio sem adenina (para gerar uma nova placa mestra de onde as colônias positivas de interesse serão purificadas) e, em seguida, em um meio onde apenas diplóides podem crescer. Isso é necessário para evitar a purificação inadvertida de colônias diplóides. No caso do exemplo da Figura 4C, apenas diplóides podem crescer em meios sem leucina. iii) A placa mestra também é replicada em meios onde apenas os haploides aceitadores que incorporaram o DNA mitocondrial de interesse crescerão. No exemplo da Figura 4C, os haplóides crescem em meios respiratórios contendo etanol / glicerol como fonte de carbono, uma vez que a proteína Cox1ΔC15 é funcional. A cepa rho + resultante com o mtDNA de interesse foi denominada XPM20925. As cepas usadas na Figura 2 e na Figura 4 estão listadas na Tabela 1.

Figure 2
Figura 2: Diagrama descrevendo um exemplo específico de transformação mitocondrial e seleção de células rho positivas. (A) A modificação pretendida do genoma mitocondrial foi uma deleção da região que codifica os últimos 15 aminoácidos da subunidade Cox1 (Cox1ΔC15). (B) Os WPs foram revestidos com dois plasmídeos para transformar células de levedura. Um foi o plasmídeo de 2 μ Yep352 que foi direcionado e expresso no núcleo. O outro foi o plasmídeo pXPM61, que contém o alelo COX1ΔC15 mais 395 nt e 990 nt dos COX1 5 ‘e 3’-UTRs, respectivamente. (C) Os WPs foram introduzidos em células da cepa NAB69, que não possui DNA mitocondrial (cepa rho0 ). As colônias transformantes obtidas das placas de bombardeio foram replicadas em um meio sem uracila, o marcador auxotrófico do plasmídeo nuclear YEp352. (D) Para selecionar as colônias rho positivas, a placa -URA foi replicada em um meio sem uracila. Esta foi a placa mestra da qual as colônias positivas foram colhidas e isoladas. Também foi replicado em placas com rich media (YPD) e um gramado de uma cepa de teste. Durante o acasalamento, o DNA mitocondrial sintético foi recombinado com o DNA mitocondrial da cepa testadora, L4527, que carrega uma mutação no gene COX1 (D369N). Os diplóides que cresceram no meio respiratório continham o DNA transformado. As colônias correspondentes foram escolhidas da placa mestra para relistrar e purificar. Para ajudar a identificar as colônias positivas na placa mestra em todas as réplicas do revestimento, foram feitas marcas com um marcador permanente nas bordas das placas (linhas verdes). (E) As colônias positivas selecionadas foram resquentadas em um meio sem uracila. Esta foi a nova placa mestre. Como em D, mais duas rodadas de testes foram realizadas para purificar as colônias sintéticas de rho. Abreviaturas: WPs = partículas de tungstênio; mtDNA = DNA mitocondrial; -URA/Sorb = sem uracila/ contendo Sorbitol; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama descrevendo o procedimento de citodução. (A) Visão geral de como as células se acasalam durante a citação. Durante a citodção, as mitocôndrias das cepas doadora e receptora se fundem para que o DNA mitocondrial de ambas as cepas se recombine. Como a fusão nuclear é reduzida devido à mutação kar1-1 30, os zigotos binucleares são formados. Após algum tempo de incubação / recuperação, os brotos de zigotos binucleares e os aceptores haplóides contendo a mutação mitocondrial pretendida são selecionados. (B) O acasalamento da cepa sintética (doadora) e da cepa aceptora por meio da citoducção permite a formação de shmoos (setas vermelhas), uma forma característica da levedura de acasalamento. A imagem foi tirada em microscópio óptico com objetiva de 100x. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Diagrama descrevendo um exemplo específico de citoducção para integrar a mutação COX1ΔC15 no genoma mitocondrial. (A) Culturas líquidas da cepa rho sintética (doador, XPM199) e da cepa de interesse (aceptor, XPM10) foram misturadas para acasalar. Após a formação do shmoo, a mistura foi recuperada em uma cultura líquida por 2-4 h. Em seguida, a mistura de citoducção foi espalhada em uma placa com um meio sem adenina para evitar o crescimento das células doadoras. (B) Representação esquemática dos eventos de recombinação do DNA mitocondrial do doador (XPM199) e do aceptor (XPM10) durante a citação. (C) A placa mestra foi replicada em diferentes meios seletivos para identificar e purificar os haplóides que integraram o gene mitocondrial pretendido no DNA da organela (XPM209) 25. Abreviaturas: -ADE = sem adenina; -LEU = falta de leucina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

NOTA: Recomendamos fazer seis transformações para cada construção, pois a eficiência da transformação mitocondrial geralmente é baixa. A composição dos diferentes meios de crescimento é mostrada na Tabela 2. 1. Preparação de partículas de tungstênio Pesar 30 mg de partículas de tungstênio de 0,7 μm (WPs, microtransportadores) em um microtubo. Adicione 1,5 mL de etanol a 70% (EtOH) para esterilizar. Vortex os WPs e deixe-os descansar…

Representative Results

Esta seção apresenta alguns resultados representativos dos diferentes estágios da transformação mitocondrial. A Figura 6 mostra um procedimento de bombardeio. As células rho sintéticas carregavam um plasmídeo bacteriano com o gene repórter ARG8m, que substituirá a sequência codificadora de um gene mitocondrial (Figura 6A). Após o bombardeio, a placa foi replicada em um meio sem uracila (-URA); esta é a placa me…

Discussion

O presente trabalho descreveu como transformar mitocôndrias da levedura S. cerevisiae com sucesso. O processo, desde o bombardeio de microprojéteis de alta velocidade até a purificação da cepa de levedura pretendida, leva ~ 8-12 semanas, dependendo de quantas rodadas de purificação da cepa de rho sintética são necessárias. Algumas das etapas críticas do método são as seguintes. Primeiro, quanto maiores as regiões flanqueadoras adicionadas ao redor do local da mutação na construção d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta publicação foi financiada pelo Programa de Apoio a Projetos de Investigação e Inovação Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. UPD é um membro do CONAHCYT (CVU:883299). Queremos agradecer à Dra. Ariann Mendoza-Martínez pela ajuda técnica com as imagens do microscópio óptico. Licenças de biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

Materials

1 mL pipette tips Axygen T-1000-B
1.5 mL Microtube Axygen MCT-150-C
10 μL pipette tips Axygen T-10-C
15 mL conical bottom tube  Axygen SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips Axygen T-200-Y
50 mL conical bottom  tube Axygen SCT-50ML-25-S
AfiII New England BioLabs R0520S
Agarose SeaKem 50004
Analytic balance OHAUS ARA520
Autoclave TOMY ES-315
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Biolisitic Macrocarrier holder  BIO-RAD 1652322
Bunsen burner VWR 89038-528
Calcium chloride Fisher Scientific C79-500
CSM -ADE Formedium DCS0049
CSM -ARG Formedium DCS0059
CSM -LEU Formedium DCS0099
CSM -URA Formedium DCS0169
Culture glass flask KIMAX KIMBLE 25615
Culture glass tube Pyrex 9820
Dextrose BD 215520
Ethanol JT Baker  9000
Forceps Millipore 620006
Glass beads Sigma Z265926
Glass handle Sigma S4647
Glycerol JT BAKER 2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)
HSTaq  Kit PCR BIO
Microcentrifugue Eppendorf 022620100
NdeI New England BioLabs R0111L
Orbital shaker New Brunswick scientific NB-G25
PCR tubes Axygen PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System BIO-RAD 165-2257
Petri dishes (100X10) BD 252777
QIAprep Spin Miniprep Qiagen 27106
Raffinose Formedium RAF03
Replica plater Scienceware Z363391
Rupture discs 1350 Psi BIO-RAD 1652330
Sorbitol Sigma S7547
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase Thermo Scientific EL0011
Tissue Culture Rotator Thermo Scientific 88882015
Tungsten microcarriers M10 BIO-RAD 1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity
Velvet pads Bel-Art H37848-0002
Vortex  Scientifc Industries SI-0236
Wood aplicator stick PROMA 1820060
Yeast extract BD 212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids BD 291920

References

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965 (2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359 (2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), e4146 (2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. . Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. . Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144 (Pt 1), 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).
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Camacho-Villasana, Y., Pedroza-Dávila, U., Perez-Martinez, X. Mitochondrial Transformation in Baker's Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly. J. Vis. Exp. (208), e66856, doi:10.3791/66856 (2024).

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