Mitochondriale transformatie bij Baker

De gist Saccharomyces cerevisiae is een algemeen erkend model dat wordt gebruikt om mitochondriale biogenese te bestuderen. Aangezien gist een anaëroob, facultatief organisme is, is het mogelijk om de oorzaken en gevolgen van het introduceren van mutaties die de ademhaling belemmeren uitgebreid te bestuderen. Bovendien beschikt dit organisme over vriendelijke genetische en biochemische hulpmiddelen om mitochondriale routes te bestuderen. Een van de krachtigste bronnen om de mechanismen van de assemblage van respiratoire complexen en mitochondriale eiwitsynthese te onderzoeken, is echter het vermogen om mitochondriën te transformeren en het genoom van de organel te wijzigen. Eerder was het nuttig om in het mitochondriaal DNA (mtDNA) puntmutaties of kleine deleties/inserties ^1,2,3,4,5 te introduceren, genen ^6,7 te verwijderen, genherschikkingen te maken ^7,8, epitopen toe te voegen aan mitochondriale eiwitten ^9,10, genen te verplaatsen van de kern naar de mitochondriën^11,12, en introduceer reportergenen zoals BarStar¹³, GFP^14,15, luciferase¹⁶ en de meest gebruikte ARG8^m17,18. Mitochondriale genoommodificaties hebben ons in staat gesteld om mechanismen te ontleden en te identificeren die anders moeilijk te begrijpen zouden zijn geweest. Het ARG8 m-reportergen dat op de COX1-locus in het mitochondriaal DNA werd ingebracht, was bijvoorbeeld cruciaal om te begrijpen dat Mss51 een dubbele rol speelt in de biogenese van Cox1. Ten eerste is het een translationele activator van het COX1-mRNA en ten tweede is het een assemblagechaperonne voor het nieuw gemaakte Cox1-eiwit ^7,19. Dit werk presenteert een gedetailleerde methode om S. cerevisiae mitochondriën te transformeren. Hoewel het mitochondriale transformatieprotocol al eerder werd gepubliceerd 16,20,21,22,23, is een visuele benadering door middel van een video essentieel om de verschillende stadia en details van de methode grondig te begrijpen. De methode bestaat uit verschillende stappen en is onderverdeeld in vier algemene fasen:

Figuur 1: Overzicht van de mitochondriale transformatieprocedure door microprojectielbombardement met hoge snelheid: 1) De wolfraamdeeltjes worden gesteriliseerd en geprepareerd voordat ze worden gecoacht. 2) Twee verschillende plasmiden worden neergeslagen op het oppervlak van de WP’s. Een daarvan is een bacterieel plasmide dat het construct bevat dat naar de mitochondriale matrix zal worden geleid. De andere is een nucleaire gistexpressievector met een auxotrofiemarker. 3) Een receptorgiststam zonder mitochondriaal DNA (rho⁰) wordt gekweekt op een fermentatieve koolstofbron zoals galactose of raffinose, die geen glucoseonderdrukking van mitochondriale genexpressie uitoefent^34,35. De cultuur wordt uitgespreid op petrischaaltjes met het medium bombardement. 4) WP’s bedekt met plasmiden worden naar de receptorstam geschoten door microprojectielbombardementen met hoge snelheid. 5) Positieve synthetische ^rho-kolonies die het mitochondriale plasmide bevatten, worden geselecteerd door te paren met een teststam. 6) Het mitochondriale construct wordt op de gewenste locus geïntegreerd in het mitochondriale genoom door de synthetische ^rho-stam (donor) te paren met de acceptorstam via een proces dat bekend staat als cytoductie. 7) De positieve receptor, haploïde stam die het mitochondriale construct draagt, wordt geselecteerd en gezuiverd in verschillende media. Afkortingen: WPs = wolfraamdeeltjes; mtDNA = mitochondriaal DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Transformatie van cellen met het DNA-construct dat bedoeld is om te integreren in het mitochondriale genoom (Figuur 1, stappen 1-4)
Hoewel het mogelijk is om een gist met een compleet mitochondriaal genoom (rho⁺) direct te transformeren, is de transformatie 10-20x efficiënter als de cellen mitochondriaal DNA (rho⁰)²⁴ missen. Wolfraamdeeltjes (WP’s) worden gecoat met twee verschillende plasmiden die samen zullen worden getransformeerd. De eerste is een gist 2 μ expressievector met een auxotrofiemarker, zoals LEU2 of URA3 (bijv. YEp351 of YEp352, respectievelijk). Als de biolistische introductie van DNA in de gistcellen succesvol is, zullen de transformanten groeien op het auxotrofiemedium (d.w.z. een medium zonder leucine of uracil). Dit plasmide is nuttig bij het maken van de eerste selectie van de cellen die het nucleaire plasmide hebben verworven; Anders zou het aantal resulterende kolonies de plaat verzadigen. Het tweede plasmide is een bacterieel plasmide (zoals pBluescript of iets dergelijks) dat de mitochondriale constructie bevat die bedoeld is om te worden geïntegreerd in het mitochondriale genoom. Het construct moet ten minste 100 nt flankerende mitochondriale sequenties van 5′ en 3′ bevatten voor recombinatie met het mitochondriale gebied van belang. In onze ervaring is de kans groter dat grotere flankerende sequenties met succes recombineren met de doellocus in het mitochondriale genoom.

Een specifiek voorbeeld is weergegeven in figuur 2²⁵. In dit voorbeeld was het doel om het gebied van het mitochondriale COX1-gen te verwijderen dat codeert voor de laatste 15 aminozuren van het overeenkomstige eiwit (Cox1ΔC15) (Figuur 2A). Het bacteriële plasmide met de COX1ΔC15-mutatie bevatte respectievelijk 395 nt en 990 nt van de 5′ en 3′ niet-vertaalde regio’s van het gen. Het plasmide was afgeleid van pBluescript (pXPM61) en samen met het 2 μ plasmide YEp352 werden ze gecoprecipiteerd op het oppervlak van WP’s (Figuur 2B). De WP’s werden vervolgens door middel van een microprojectielbombardement in de geselecteerde ontvangende stam geïntroduceerd (Figuur 2C). Deze stam, NAB69²⁶ genaamd, is een MATa, rho 0-stam met de allelen kar1-1 en ade2 (het belang van deze kenmerken wordt hieronder besproken). De cellen werden geplateerd op bombardementsmedia zonder uracil om die cellen te selecteren die het 2 μ plasmide hadden verworven (Figuur 2C). De cellen werden gedurende 5-7 nachten bij 30 °C gekweekt.

Selectie van de cellen die het bacteriële plasmide met het mitochondriale construct en het nucleaire 2 μ plasmide met de auxotrofiemarker hebben verworven (Figuur 1, stap 5)
De positieve kolonies zullen veel kopieën van het bacteriële plasmide in hun mitochondriën behouden²². Aangezien de getransformeerde cellen oorspronkelijk rho⁰ zijn, ondersteunen geen mitochondriale sequenties de translatie van het mitochondriale construct dat aanwezig is in het plasmide; Daarom zal het getransformeerde mitochondriale gen niet tot expressie worden gebracht. Het is noodzakelijk om de transformatoren te paren met een teststam om de gistkolonies te detecteren die het mitochondriale plasmide hebben verworven. Het mitochondriale genoom van de teststam bevat een niet-functionele gemuteerde versie van het gen in kwestie. Na de paring zullen de mitochondriën samensmelten en zal de mitochondriale sequentie die in het getransformeerde plasmimide is opgenomen, recombineren met het gemuteerde mitochondriale gen van de testerstam; bijgevolg zal het herstel van het WT-gen de functie herstellen. De resulterende diploïde zal een detecteerbaar positief fenotype hebben (meestal het vermogen om te groeien in een respiratoir medium of een medium zonder arginine). De positieve cellen die het bacteriële plasmide in mitochondriën dragen, worden “synthetische ^rho-cellen ” genoemd. In het specifieke voorbeeld van figuur 2D werden synthetische ^rho-cellen met het COX1ΔC15-construct (XPM199 genaamd) gerepliceerd op een medium zonder uracil (dit is de hoofdplaat waaruit positieve kolonies werden gezuiverd). Ze werden ook gerepliceerd op een tester stam L45²⁷ gazon, dat de niet-functionele mutatie cox1D369N bevat. Na twee nachten paren recombineerde het mitochondriale genoom van L45 en XPM199, wat resulteerde in een functioneel COX1-gen ; Daarom herstelden de diploïden het vermogen om te groeien op respiratoire media. Van de moederplaat hebben we de positieve kolonies geplukt. Ze werden gestreept op platen zonder uracil en de selectieve tests werden herhaald om zuivere synthetische ^rho-cellen te verkrijgen (Figuur 2E). Het is belangrijk op te merken dat de testplaat alleen bedoeld is voor de identificatie van synthetische ^rho-kolonies en dat mutanten niet uit deze platen kunnen worden gehaald.

Integratie van het construct in het mitochondriale genoom van de beoogde stam
Deze stap wordt bereikt door een proces dat cytoductie^28,29 wordt genoemd (Figuur 1, stap 6). Bij deze benadering wordt de synthetische ^rho-stam (donorstam) gekoppeld aan de beoogde acceptorstam van het tegenovergestelde paringstype. Een essentiële vereiste is dat ten minste één van de twee parende stammen de kar1-1-mutatie draagt om kernfusie te belemmeren³⁰. Vandaar dat de paring van de twee cellen een tweekernige zygote produceert (Figuur 3). Het mitochondriale netwerk van de oudercellen (donor en acceptor) versmelt en de mitochondriale DNA-moleculen recombineren. De tweekernige zygoten worden geïncubeerd/hersteld om knopvorming mogelijk te maken, die haploïde cellen zullen produceren. Deze haploïden dragen de nucleaire achtergrond van een van de oudercellen. Evenzo kunnen haploïden het mitochondriale DNA van de ouderlijke cel of het gerecombineerde mitochondriale DNA van belang dragen. De kar1-1-mutatie is echter niet 100% effectief en tijdens de paring zullen enkele echte diploïden worden gevormd^28,29. De synthetische ^rho-stam (donor, XPM199) droeg in het voorbeeld het kar1-1 allel. Als selectieve marker had het het ade2-allel, waardoor het een auxotroof voor adenine is (Figuur 4). De acceptorstam was XPM10, een rho^+-stam met de cox1Δ::ARG8^{m-constructie}, waarbij de verslaggever ARG8^m de COX1-codons in het mitochondriale genoom⁷ verving. Het mengsel van beide celculturen werd als druppel aan een YPD-plaat toegevoegd om paring mogelijk te maken. Na 3-5 uur werden de cellen onder een lichtmicroscoop geobserveerd om de vorming van shmoos te detecteren (Figuur 3B), een celvorm die verband houdt met paring. Na de incubatie-/hersteltijd werden de binucleaire zygoten uitgeplateerd op een medium zonder adenine om de groei van de donorcellen te voorkomen.

Selectie van de haploïde stam die het mitochondriale genoom van belang draagt (Figuur 1, stap 7)
Een mengsel van donor-, acceptor- en diploïde cellen is aanwezig na cytoductie. Daarom moeten na de incubatie/herstel van de tweekernige zygoten cellen worden gekweekt in verschillende selectieve media om de haploïden van belang te identificeren en te zuiveren. De selectieve media zijn afhankelijk van de genotypen van de donor, acceptorstammen en de beoogde mitochondriale constructie. Over het algemeen is de redenering voor het kiezen van de selectieve media echter: i) na incubatie/herstel wordt de cytoductiemix gekweekt op een selectief medium waar de donorouderstam niet kan groeien. In het specifieke voorbeeld in figuur 4A,B draagt de donor (synthetische rho-stam) het niet-functionele ade2-allel. Het cytoductiemengsel moet dus worden geïncubeerd op een middelgrote plaat zonder adenine. Dit is de moederplaat. ii) Zodra de kolonies groeien, wordt de hoofdplaat opnieuw gerepliceerd op een medium zonder adenine (om een nieuwe hoofdplaat te genereren van waaruit de positieve kolonies van belang zullen worden gezuiverd), en vervolgens op een medium waar alleen diploïden kunnen groeien. Dit is nodig om verdere onbedoelde zuivering van diploïde kolonies te voorkomen. In het geval van het voorbeeld uit figuur 4C kunnen alleen diploïden groeien op media zonder leucine. iii) De hoofdplaat wordt ook gerepliceerd op media waar alleen die acceptor-haploïden zullen groeien die het mitochondriale DNA van belang hebben opgenomen. In het voorbeeld van figuur 4C groeien haploïden op respiratoire media die ethanol/glycerol als koolstofbron bevatten, aangezien het Cox1ΔC15-eiwit functioneel is. De resulterende rho^+-stam met het mtDNA van belang kreeg de naam XPM209²⁵. De in figuur 2 en figuur 4 gebruikte stammen zijn vermeld in tabel 1.

Figuur 2: Diagram met een specifiek voorbeeld van mitochondriale transformatie en selectie van positieve ^rho-cellen. (A) De beoogde wijziging van het mitochondriale genoom was een deletie van het gebied dat codeert voor de laatste 15 aminozuren van de Cox1-subeenheid (Cox1ΔC15). (B) WP’s werden gecoat met twee plasmiden om gistcellen te transformeren. Een daarvan was het 2 μ plasmide Yep352 dat werd gericht en tot expressie werd gebracht in de kern. De andere was plasmide pXPM61, dat het COX1ΔC15-allel bevat plus respectievelijk 395 nt en 990 nt van de COX1 5′- en 3′-UTR’s. (C) De WP’s werden geïntroduceerd in cellen van de stam NAB69, die mitochondriaal DNA mist (rho^0-stam). Transformatiekolonies verkregen uit de bombardementsplaten werden gerepliceerd op een medium zonder uracil, de auxotrofe marker van het nucleaire plasmide YEp352. (D) Om de positieve rho-kolonies te selecteren, werd de –^URA-plaat gerepliceerd op een medium zonder uracil. Dit was de hoofdplaat waaruit de positieve kolonies werden geplukt en geïsoleerd. Het werd ook gerepliceerd op platen met rich media (YPD) en een gazon van een testerstam. Tijdens de paring werd het synthetische rho-mitochondriaal DNA gerecombineerd met het mitochondriaal DNA van de testerstam, L45²⁷, die een mutatie in het COX1-gen (D369N) draagt. De diploïden die op respiratoire media groeiden, bevatten het getransformeerde DNA. De bijbehorende kolonies werden van de moederplaat geplukt om te herscheppen en te zuiveren. Om te helpen bij het identificeren van de positieve kolonies in de hoofdplaat tijdens alle replicabeplating, werden markeringen gemaakt met een permanente marker op de randen van de platen (groene lijnen). (E) De geselecteerde positieve kolonies werden gestalte op een medium zonder uracil. Dit was de nieuwe moederplaat. Evenals in D werden nog twee testrondes uitgevoerd om de synthetische ^rho-kolonies te zuiveren. Afkortingen: WPs = wolfraamdeeltjes; mtDNA = mitochondriaal DNA; -URA/Sorb = zonder uracil/ bevattend Sorbitol; WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Diagram van de cytoductieprocedure. (A) Algemeen overzicht van hoe cellen paren tijdens cytoductie. Tijdens cytoductie smelten mitochondriën van de donor- en acceptorstammen samen, zodat mitochondriaal DNA van beide stammen recombineert. Omdat kernfusie wordt verminderd als gevolg van de kar1-1-mutatie ³⁰, worden binucleaire zygoten gevormd. Na enige incubatie-/hersteltijd worden de binucleaire zygoten knop- en haploïde acceptoren die de beoogde mitochondriale mutatie bevatten, geselecteerd. (B) Paring van de synthetische ^rho-stam (donor) en de acceptorstam door middel van cytoductie maakt de vorming van shmoos (rode pijlen) mogelijk, een karakteristieke vorm van paringsgist. De foto is gemaakt onder een lichtmicroscoop met een 100x objectief. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Diagram met een specifiek voorbeeld van cytoductie om de mutatie COX1ΔC15 in het mitochondriale genoom te integreren. (A) Vloeibare culturen van de synthetische ^rho-stam (donor, XPM199) en de betreffende stam (acceptor, XPM10) werden gemengd om te paren. Na shmoo-vorming werd het mengsel gedurende 2-4 uur teruggewonnen in een vloeibare cultuur. Vervolgens werd de cytoductiemix uitgespreid op een plaat met een medium zonder adenine om de groei van de donorcellen te voorkomen. (B) Schematische weergave van de recombinatiegebeurtenissen van het mitochondriaal DNA van de donor (XPM199) en de acceptor (XPM10) tijdens cytoductie. (C) De hoofdplaat werd gerepliceerd op verschillende selectieve media om die haploïden te identificeren en te zuiveren die het beoogde mitochondriale gen in het DNA van de organel integreerden (XPM209)²⁵. Afkortingen: -ADE = zonder adenine; -LEU = gebrek aan leucine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.